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蛋白质组学【入门必看】| 常见蛋白质组学技术流程

分类:公司动态   发布时间 2021-07-28   阅读: 1606

上一次小趣整理了蛋白质组学入门的一些基础知识,如什么是蛋白质组学?蛋白质组学常用技术有哪些?蛋白质组学检测仪器平台有哪些?蛋白序列数据库等等。今天我们继续探索蛋白质组学的世界,了解常见蛋白质组学技术流程!


非靶向蛋白质组学

1. iTRAQ/TMT 标记定量蛋白质组学

iTRAQ 和 TMT 技术采用多种同位素标记,可与氨基反应实现连接,实现多个样本蛋白组的定性与定量。


技术流程:


寄样要求:

动物及临床组织标本  100 mg/sample

血清、血浆  200 μL/sample

细胞、微生物  1x107 cells/sample

植物嫩叶、嫩芽  500 mg/sample

植物种子、果实  100 mg/sample

液氮或者 -80℃ 保存

足量干冰运输,避免反复冻融


试剂盒种类:


技术优点:

适用范围广、高通量、结果可靠

灵敏度高

分离能力强

自动化程度高


2. Label Free 非标记定量蛋白质组学

Label Free 技术不依赖同位素标记,可通过液质联用对蛋白质酶解肽段进行分析,分析大规模鉴定蛋白质时所产生的质谱数据,对被检测到的离子峰强度进行积分,以积分面积进行相对定量。


技术流程:


技术优点:

无需标记,最大程度的保留样本的真实性

可以区分“有”、“无”蛋白

不受标签数量的限制,多个样本可以同时进行蛋白定量分析

不同物种和不同的样本类型可以同时开展蛋白定量分析

处理步骤简单,成本低


技术缺点:

低通量

定量准确度有限

对质谱的稳定性和重现性有很高的要求


3. DIA 定量蛋白质组学

数据非依赖性采集(DIA)是一种显著提升蛋白质组学研究通量和可重复性的技术。


经典的 DIA 流程通常依赖于 DDA 谱图库的构建,需要消耗大量的样品,且周期长,成本高。


越来越多的不依赖于 DDA 建库的分析方法相继诞生,例如 DIA-Umpire、PECAN 和 encyclope DIA 等。encyclope DIA 系列技术采用气态在线分离(GPF)。


GPF-DIA 技术流程:


常规 DIA 流程:



技术优点:

采集所有离子及碎片图谱,重现性好

基于碎片离子定量,选择性好,可媲美 SPM/MRM

循环时间固定,扫描点数均匀,定量准确度高

高通量,能同时监测所有目标蛋白


4. 定性鉴定蛋白质组学

利用液相色谱质谱联用技术(LC-MS/MS)结合数据库检索的方法,对样本中的混合蛋白进行定性鉴定分析。


技术流程:

寄样要求:

  • 胶条样本

考马斯亮蓝染色 SDS-PAGE 凝胶,条带清晰可见

条带切取操作过程中佩戴手套,防止角蛋白污染

条带置于 EP 管中,-20℃ 保存,冰袋运输


  • 蛋白溶液

需要提供缓冲液体系以及蛋白浓度数据

蛋白溶液样本中不要加入 loading buffer

液氮或 -80℃ 保存

足量干冰运输,避免反复冻融


5. 多肽组学

多肽组学是以机体内源性多肽和低分子量蛋白质为研究对象,研究多肽组的结构、功能、变化规律及其相关关系。


技术流程:


技术优点:

高效

高通量

高特异性

破坏度小

高灵敏度



靶向蛋白质组学

(PRM 靶向定量蛋白组)


平行反应监测(PRM)是一种靶向检测方法,能够对目标蛋白、目标肽段进行选择性检测,从而实现对目标蛋白/肽段进行相对(绝对)定量。


技术流程:


技术优点:

不依赖抗体

特异性

结果准确、可靠

高通量


修饰蛋白质组学


利用 LC-MS/MS 结合数据库检索的方法,在搜库时设置修饰搜库参数,实现对目标所有已知的修饰位点磷酸化、乙酰化、糖基化和泛素化进行鉴定。


技术流程:



蛋白代谢互作组


代谢物-蛋白质相互作用控制着多种细胞过程,从而在维持细胞稳态中发挥重要作用。MetPro 技术是一种化学蛋白质组学方法,将蛋白质水解(Lip)和质谱(MS)结合起来。用于进行代谢物-蛋白质相互作用的研究,筛选与代谢物具有相互作用的蛋白质。


技术流程:


蛋白组生信分析


1. 基础分析

 数据预处理

 差异表达蛋白筛选


2. 常规数据分析


 主成分分析

火山图分析


层次聚类分析

3.功能分析


 COG 注释分析

亚细胞定位分析


GO 注释富集分析


KEGG 注释富集分析


PPI 网络构建分析


4.修饰蛋白特有分析


Motif 分析

激酶(kinase)预测分析