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上分攻略 | 蛋白质组学FAQ-2

分类:公司动态   发布时间 2021-10-21   阅读: 139

上期的蛋白组学FAQ文章推出后(上分攻略1 | 蛋白质组学FAQ)老师们积极关注,那么这期再给各位老师整理些经常咨询的问题,以供参考。


Q & A

  Q1  蛋白组一般是建议做多少个生物学重复?

A: 原则上是生物学重复越多越好,排除个体差异,筛选的差异蛋白更准确,验证成功率更高。考虑到经费、统计分析需要及后续编辑可能会质疑的情况,临床样本建议每组十个重复以上,其他来源样本每组至少三个重复。



  Q2  蛋白组样本如何寄送?

A: 常规组织、细胞、体液等生物样本需要低温保存,干冰寄送。胶条样本可以冰袋寄送。



  Q3  : 蛋白组学能否测未知的蛋白?或者是表达的外源蛋白,该样本物种数据库里没有的蛋白能否测到?

A: 蛋白组学检测结果是与已知的数据库蛋白进行比对,无法预测未知的蛋白,如果需要检测未知蛋白,可采用测序等其他方法。如果数据库里不包含关注的蛋白,那么无法比对到。可以将关注的蛋白序列加入到数据库里作为搜库文件进行分析。



  Q4  : 磷酸化蛋白组学实验的流程?

A: 磷酸化蛋白组可以做非标记产品,也可以做标记产品。目前标记产品做的较多,可以增加检测深度。实验流程主要是包括样本前处理、蛋白的提取、蛋白浓度的测定和跑胶质控、酶解成肽段、修饰肽段的富集、(肽段标记)、质谱检测。方案多样化,可以进行选择,可以先富集再分级再检测,或者先标记、分级、每级富集等等。



  Q5  : 蛋白检测结果较少是为什么呢?

A: 首先可能是数据库比较小的原因,导致检测到的结果比较少。可以选择扩大层级或者选择研究较多的近缘物种、模式物种数据库进行搜库分析。其次看下胶图,判断样本本身条带是否较少,是否存在高丰度蛋白,高丰度蛋白的存在会影响检测数量。



  Q6  : 鉴定到的蛋白与凝胶电泳图谱中估测分子量差异很大的原因?或者为什么SDS-PAGE胶上不同位置条带的质谱鉴定结果中含有同一个蛋白?

A: 由于体内或者体外因素,导致同一蛋白存在不同形式的修饰、剪切或者降解,从而形成凝胶电泳图中能够看到的存在差异分子量的蛋白条带。然而这些蛋白在质谱鉴定时会同时指向数据库中同一个、全长的、无修饰的蛋白理论序列。因此会出现凝胶电泳图中的蛋白分子量(实际分子量)与鉴定的蛋白分子量(理论分子量)不同的情况。



  Q7  : 差异蛋白如何筛选?

A: 差异蛋白筛选的条件主要是结合T检验的p值和FC值,一般标记产品按照FC>1.2 or FC<0.83,p<0.05;非标记产品按照FC>1.5 or FC<0.67,p<0.05进行筛选。实际过程中也会结合检测结果进行放宽或者卡严,一般控制在检测结果20%以内,5-10%为佳。



  Q8  : 做完蛋白组学,选用何种方法验证呢?

A: 常规蛋白验证方法主要包括WB、ELISA、PRM。如果关注的蛋白数量不多且有对应的商品化检测试剂盒或者抗体,建议选择ELISA或WB方法进行验证,此方法更为成熟。如果关注的蛋白数量较多,也没有商品化的抗体,建议选用PRM的方法。经费充裕的情况下,抗体制备也是一个不错的选择。



  Q9  通过western blot检测到的蛋白,为什么质谱没有检测到或者只检测到一个肽段?

A: Western blot 检测是将目的蛋白信号放大很多级之后进行检测的,灵敏度很高,(除非特异性结合之外)几乎不受复杂样品中背景蛋白丰度的影响。质谱检测时样品中丰度较高的蛋白优先、多次被检测到,而丰度较低的蛋白则因为肽段信号过弱被淹没而不能被检测到。因此,如果样品中待检测的目标蛋白丰度较低,即使WB能够检测到,质谱并不一定能检测到或者仅能检测到较少的肽段数。



  Q10  : 同一批样本,转录组数据下调,但是蛋白组学结果上调,这种是什么情况?

A: 这是正常的现象,上下游不是一一对应的关系,常规mRNA与蛋白质间的相关系数仅为0.4~0.5。一个蛋白的表达受到很多因素的控制,除了这个蛋白对应的mRNA之外,还有比如转录因子,增强子,抑制子,DNA和RNA的修饰作用等等。


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