新闻资讯

NEWS

文献分享 | 肠菌代谢再添“新”明星——PAGln

分类:行业资讯   发布时间 2020-04-14   阅读: 198

肠菌这个瓜,科研人员吃不饱;代谢这个梗,小编更玩不腻;两者一结合,简直是王炸,必然是CNS常客,因为每次都有新发现,每次都有新感觉。这不,2020年3月5日,肠道菌群通过代谢影响疾病再添新成员,还不快来跟小编一起吃瓜聊梗。

代谢组学
心血管疾病(CVD)相关的肠道菌群代谢物通过肾上腺素能受体发挥作用

1
研究背景

心血管疾病(CVD)是西方国家死亡率较高的疾病之一,而2型糖尿病(T2DM)患者罹患心血管疾病及其重大不良心脏事件(major adverse cardiac events,MACE)的风险明显较高,包括心肌梗塞、中风或死亡,单纯使用控制血糖的药物并不能有效降低CVD或者MACE风险,这表明,T2DM可能通过其他代谢途径影响CVD风险。

2
研究结果

1.非靶标代谢组学证实PAGln与CVD有关

首先,作者对初始发现队列1162个受试者血浆样本进行非靶标代谢组学分析,结果显示:与MACE预测相关的候选代谢物中,已知结构的代谢物如氧化三甲胺(TMAO)、三甲基赖氨酸(TML)已经有文献报导与肠菌代谢和心血管疾病风险有关。然而,其中未知化合物m/z 265.1188在(3年)MACE风险的危险比(HR)为95%(图1A和1B)。随后作者通过多种方法确证该物质为苯乙酰谷氨酰胺PAGln(图1C)。

接下来,作者对独立验证队列4000个受试者血浆样本进行靶标代谢组学分析,结果显示T2MD患者血浆中PAGln水平较高(与非糖尿病患者相比,P=0.0002),以及MACE患者之间血浆中PAGln水平也较高(与非MACE患者相比,P<0.0001);Kaplan-Meier生存分析表明PAGln水平高的受试者发生MACE风险更大(3年)(图1D);此外,在调整传统心脏危险因素后,较高的PAGln水平仍然是MACE风险的独立预测因子(图1E)。

代谢组学
图1.非靶标代谢组学研究发现,m/z为265.1188的代谢物与心血管疾病风险相关,随后被鉴定为苯乙酰谷氨酰胺

2.肠道菌群参与体内苯乙酰谷氨酰胺(PAGln)和苯乙酰甘氨酸(PAGly)的形成

通过分析比较人类未服用抗生素(Pre-Abx)、服用抗生素7天(Abx)和停用抗生素大于3周(Post-Abx)后血浆中PAGln浓度,从而确立肠道菌群对PAGln生成的贡献(图2A)。作者通过对比人类和小鼠实验结果,发现口服抗生素混合物处理前后,人类血浆中PAGln含量水平比PAGly高出一个数量。相比之下,小鼠的PAGly水平比PAGln高一个数量级,经腹腔注射的PAA主要代谢为PAGly,肠道菌群是PAA形成PAGly的关键参与者(图2B-D)。因此,在人类和小鼠中,PAGln和PAGly在体内都是通过代谢途径产生的,在这种途径中,膳食中的Phe被肠道菌群转化为PAA,在这一点上,宿主与Gln(人类首选)或Gly(啮齿动物首选)发生接合反应,分别产生PAGln和PAGly(图2E)。

代谢组学
图2.PAGln在人体和小鼠体内的产生是一个依赖肠道菌群的过程

3.PAGln增强血小板刺激诱导的钙释放和对多种激动剂的反应性

之前结果(图1)表明PAGln对血小板功能及与血管基质的相互作用有潜在影响。因此,作者进一步研究了PAGln是否在生理剪切力下影响全血中血小板与胶原表面的粘附。结果显示:PAGln能够提高胶原蛋白依赖性血小板粘附和扩散的速度(图3A-3C),还呈剂量依赖性地增强血小板聚集的程度(图3D)。PAGln还可剂量依赖性地增强血小板对ADP的反应(图3E)以及对糖蛋白ɑ2β3(GP IIb/IIIa)的激活(图3F)。进一步实验验证表明,单独用PAGln预孵育血小板对基线[Ca2+]水平没有影响(图3G,左)。然而,暴露于生理水平的PAGln可剂量依赖性地增强次极量(0.02U)凝血酶引起的[Ca2+]升高(图3G)。以上数据表明,肠道菌群依赖性代谢产物PAGln和PAGly显著影响血小板功能,增强血小板与胶原基质的黏附,增强血小板刺激依赖性的[Ca2+]升高和对激动剂的聚集反应。

代谢组学
图3.PAGln增强血小板反应性

4.PAGln促进血小板凝块形成并增强体内血栓形成潜能

PAGln和PAGly对体内血栓形成的影响采用FeCl3诱导的颈动脉损伤模型,这是一种常用的诱导血栓形成的实验方法。腹腔注射PAGln或PAGly后,PAGln或PAGly分别显著升高。对小鼠的注射(图S3A),以及颈动脉损伤后血小板凝固率和颈动脉内血流停止时间进行了量化。值得注意的是,PAGln和PAGly各自都诱导受损颈动脉内血小板血栓形成增加(图4A),与营养前体Phe或生理盐水(载体)治疗的小鼠相比,损伤后停止血流的时间(即阻断时间)相应减少(图4B)。

5.肠道菌群基因porAfldH在体内调节宿主血栓形成潜能

接下来,作者测试了在宿主内促进PAGln/PAGly生成的共生体和基因是否可以调节体内的血小板功能和血栓形成潜力。文献报道Phe主要由产孢梭菌(C. sporogenes)代谢为PAA和苯丙酸(PPA),其中参与反应的酶主要由porAfldH基因编码。于是作者构建缺乏porAfldH基因功能的产孢梭菌突变株,结果发现,同时具有功能性porAfldH基因的(ΔcutC)产孢梭菌只产生同位素标记的PPA而不产生PAA,ΔcutCΔfldH突变体(仍然具有功能性PorA) 不再产生PPA,但确实产生了PAA(图4C)。相反,(ΔcutCΔporA)产孢梭菌突变体(仍具有功能性fldH)不再产生PAA,而只产生PPA。正如体外培养数据(图4C)所预测的那样,(ΔcutCΔfldH)产孢子菌在GF小鼠中的定植导致PAGly水平显著高于(ΔcutC)产孢子菌定植的小鼠(图4D)(p<0.001)。动脉损伤后,在带有(ΔcutCΔfldH)产孢梭菌突变体的小鼠中,血栓生成率和受损血管内血流停止的时间都显著降低,产生更高水平的PAA,从而产生更高水平的PAGly(图4D)。

图4.PAGln和PAGly增强体内血栓形成潜能

6.PAGln显示与细胞的饱和和特异性结合,提示具有特异性的受体-配体结合作用

为了验证PAGln是否显示出与细胞受体结合,作者使用动态质量重分布(DMR)技术实时检测活细胞中依赖配体的整合细胞反应。对人骨髓来源的巨核细胞(MEG01)潜在结合配体(PAGln与Norepi与Phe)浓度增加的检测表明,DMR剂量-反应曲线是饱和的和特异的,这是配体受体与PAGln和Norepi相互作用的典型过程,但不是Phe的典型相互作用过程(图5A)。在平行研究中,PAGln与人骨髓来源的红白血病细胞(HEL92.1.7)结合后,也观察到饱和和特异的DMR剂量反应信号。

7.PAGln通过G蛋白偶联受体介导细胞事件

通过联合使用所有三种调节剂(PTX、CTX和YM-254890)或使用全局GPCR抑制剂SCH-202676,可以显著降低PAGln诱导的DMR反应,这强烈表明GPCR参与了细胞对PAGln的反应(图5B,左)。此外,用甲氨蝶呤或环磷酰胺预处理细胞,但不用YM-254890预处理,可显著抑制PAGn诱导的DMR反应,提示GAI/O和GAS参与其中(图5B,左)。此外,对Norepi的DMR响应的检查显示,与每一种已知的GPCR调节剂孵育时,DMR信号显著减少(图5B,中间)。相反,含有胶原的DMR信号(阴性对照)不受细胞对每个已知GPCR调节剂的预处理的影响(图5B,右)。进一步检测细胞内cAMP或[Ca2+]变化,发现PAGln确实引起了MEG01细胞(图5C)和分离的人血小板(图5D)中cAMP短暂(5分钟内)显著性的增加(约20%-30%),此外,用已知的GPCR调节剂预处理显示CTX或GPCR抑制剂SCH202676抑制PAGln诱发的cAMP生成,提示PAGln暴露触发了Gαs介导的腺苷酸环化酶的激活。

代谢组学
图5.PAGln通过G蛋白偶联受体和ADRs介导细胞反应

8.肠道菌群依赖的代谢物PAGln通过ADRs发挥作用

尽管人类基因组内存在800多种不同的GPCR,但作者注意到PAGln与儿茶酚胺的结构有些相似,儿茶酚胺已知与大型多基因ADR家族结合(图5E)。值得注意的是,α2A,β2B和β2 ADRs这三种ADR的每一种siRNA在PAGln诱导的MEG01细胞中的DMR反应中都显示出显著的降低,而对照siRNA没有任何影响(图5F)。三种抑制剂均可显著降低PAGln与MEG01细胞孵育所诱导的DMR反应,而单独使用抑制剂不影响DMR反应(图5G)。最后,ICI118,551和普萘洛尔,而不是RX821002,可以抑制PAGln(5分钟暴露)诱导的MEG01细胞(图5H)。因此,在多种细胞类型中采用遗传学或药理学方法进行的功能丧失和功能获得研究证实,PAGln可以通过α2A,β2B和β2 ADRs诱导细胞反应。

9.功能获得研究证实PAGln可以通过α2A,β2B和β2 ADRs发出信号

为进一步证实PAGln通过ADRs发挥功能的能力,作者通过在人胚肾细胞(HEK293)中分别过表达α2A,β2B和β2 ADRs进行了功能增益研究,选择这些细胞是因为它们的内源性ADR密度相对较低。当亲本或空载体(EV)转染的HEK293细胞与PAGln共同孵育时,PAGln诱导的DMR反应在瞬时转染ADRA2A基因(α2A-HEK293)或稳定转染ADRA2B基因(β2B-HEK293)或稳定转染ADRA2B基因(β2-HEK293)的HEK293细胞中观察到增强的PAGln诱导的DMR反应(图6A)。在补充功能获得研究中,作者分析了PAGln对cAMP水平的影响。值得注意的是,亲本HEK293细胞没有显示PAGln诱导的细胞内cAMP水平的变化(绿线),而b2-HEK293细胞显示PAGln诱导的胞浆cAMP水平显著增加(蓝线)(图6B)。

10.选择性ADR抑制剂降低PAGln诱导的血小板高反应性和体内血栓形成速度

上述研究表明,ADR阻滞剂在CVD中的一些潜在益处可能来自于拮抗PAGln诱导的效应。与此一致,作者观察到从低PAGln水平的健康志愿者中恢复的PRP暴露于病理生理相关水平的PAGln增强了亚极量ADP刺激的血小板聚集反应。同时,在普萘洛尔、ICI118,551或RX821002存在的情况下暴露PAGln可减弱PAGln诱导的血小板高反应性(图6C)。此外,两种ADR抑制剂都没有对亚极量ADP刺激的血小板聚集反应产生直接影响(但取消了PAGln增加的血小板聚集反应;图6C)。因此,每种ADR抑制剂的加入都逆转了PAGln引起的血小板高反应性。

在最后一系列研究中,作者检验了临床上广泛使用的b-受体阻滞剂卡维地洛对PAGln诱导的体内血栓形成增强的影响。研究如前所述(图4),检查PAGln对FeCl3诱导的动脉损伤、血小板血栓形成率和血管闭塞时间的影响。值得注意的是,在没有β-受体阻滞剂治疗的情况下,PAGln再次显著加快了血小板血栓形成的速度(图6D),并缩短了血流停止的时间(图6E)。虽然仅用卡维地洛治疗小鼠对体内血栓生成速率或动脉损伤后停止血流的时间没有影响(图6E),但卡维地洛可逆转PAGln的促血栓作用(图6D和6E)。

代谢组学
图6.PAGln通过ADRs调节血小板功能和体内血栓形成潜能

3
小结

HTTP/1.1 401 Access Denied