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Blood:肠道微生物代谢物氧化三甲胺通过诱导M1巨噬细胞极化加重GVHD

分类:行业资讯   发布时间 2020-07-21   阅读: 156

代谢组学
文献ID:Gut microbial metabolite trimethylamine N-oxide aggravates GVHD by inducing M1 macrophage polarization in mice
发表期刊:Blood
发表日期:2020-04-14
影响因子:16.562
通讯作者及单位:复旦大学华山医院的陈彤团队和复旦大学附属妇产科医院姜桦团队
关键词:氧化三甲胺(TMAO);肠道菌群;GVHD;胆碱饮食

导读
短链脂肪酸和吲哚被证明可以降低移植物抗宿主病(GVHD)的严重程度,但人类肠道菌群的多样性决定微生物代谢产物的多样化,可能对GVHD的影响具有差异性。来自复旦大学华山医院的陈彤团队和复旦大学附属妇产科医院姜桦团队近期发表在《Blood》上的文章显示,肠道微生物代谢产物TMAO通过NLRP3依赖的机制诱导M1巨噬细胞的极化,进而增强Th1和Th17的分化,加剧小鼠GVHD的严重程度。文章揭示出宿主胆碱饮食、微生物代谢产物和GVHD之间的联系,提示通过控制胆碱饮食或是减轻GVHD的有效策略。

01
摘要

①氧化三甲胺(TMAO)或高胆碱饮食加剧同种异体的移植物抗宿主病(GVHD),而胆碱类似物3,3-二甲基-1-丁醇可逆转TMAO引起的GVHD严重性;
②在GVHD小鼠体内观察到TMAO诱导的同种异体T细胞增殖和分化为T辅助亚型,但体外培养中未发现;
③TMAO通过增强NK-kB的核定位诱导NLRP3表达,通过线粒体的ROS激活NLRP3,从而在体内和体外诱导巨噬细胞的M1极化;
④在使用TMAO的情况下,GVHD小鼠体内NLRP3的缺失不仅阻断了M1极化,且逆转了GVHD的严重性。

02
背景介绍

严重的移植物抗宿主病(graft-versus-host disease, GVHD)使异源造血干细胞移植(allo-hematopoietic stem cell transplantation, HSCT)的应用受到限制,这是导致非复发死亡(non-relapse mortality, NRM)的主要原因。异体HSCT的调理方案引起宿主组织损伤,激活宿主抗原提呈细胞(antigen presenting cells, APC),主要包括巨噬细胞和树突状细胞,将宿主抗原呈给供体T细胞,产生T细胞刺激细胞因子。扩张的同种异体T细胞反过来攻击宿主器官,包括皮肤、肝脏、肠道和造血系统,导致器官损伤和功能失调。

肠道微生物代谢物已被报道引发炎症反应及炎症相关疾病。肠道菌群组成的变化与病理过程有关,其中肠道菌群产生广泛的生物活性代谢物可作为微生物对宿主影响的介质。

03
主要结果

1.TMAO可加剧GVHD小鼠的严重性和死亡率

构建小鼠模型确定TAMO饮食干预是否会影响GVHD的严重程度。

代谢组学
Figure 1. TMAO aggravated the severity and mortality of GVHD mice. 

(A)受体小鼠给予TMAO,使血清TMAO升高; 
(B)与TCD-BM 受体相比,TCD-BM+T (GVHD)受体血清氧化三甲胺(TMAO)浓度高于对照组;
(C~D)生存曲线表明TMAO治疗的TCD-BM+T受体的存活率和GVHD评分明显低于对照组;
(E~F)TMAO治疗的GVHD小鼠出现较严重的GVHD靶组织损伤及组织学评分升高;

小结:TMAO加重了T细胞在异源性HSCT中诱导GVHD的严重程度。

2.DMB降低了高胆碱饮食产生的TMAO,减少了胆碱喂养的GVHD小鼠的组织损伤

构建小鼠模型评估高胆碱饮食对GVHD严重程度的影响及高胆碱饮食是否会改变GVHD小鼠的肠道菌群。

代谢组学
Figure 2. DMB decreased high choline diet-produced TMAO and reduced tissue damage in choline-fed GVHD mice.

(A)在饮用水中存在或不存在3,3-二甲基-1-丁醇(3,3-dimethyl-1-butanol, DMB)的情况下,给小鼠喂食对照饲料或胆碱补充饲料;
(B)胆碱饮食可显著提高GVHD小鼠血清TMAO浓度,饮水中添加DMB可显著降低血清TMAO浓度;
(C~D)补充胆碱饮食的TCD-BM+T组表现为生存曲线明显缩短,GVHD评分升高。口服DMB降低了胆碱诱导的GVHD的严重程度。DMB在是否补充胆碱的情况下对GVHD的严重程度和生存曲线没有显著影响;
(E~F)胆碱喂养小鼠的内脏GVHD更加严重,表现为组织学评分升高,而添加DMB的饮用水可防止胆碱诱导的组织病理学损伤;
(G~H)高胆碱喂养的小鼠和对照组饮食喂养的小鼠的细菌多样性和丰富度没有显著差异;
(I)九类肠道微生物群在胆碱饮食组表现为菌群效应量变化。

小结:胆碱饮食中GVHD严重程度的增加与氧化三甲胺的产生有关。

3.TMAO喂养的GVHD小鼠中发现Th1和Th17的分化,而在TMAO补充的体外培养体系中则没有

探索TMAO诱导的GVHD恶化的潜在机制。

代谢组学
Figure 3. Th1 and Th17 differentiation was seen in TMAO-fed GVHD mice but not in TMAO-supplemented in vitro culture system.

(A)TMAO饮食干预及对照组小鼠造模;
(B)注入TCD-BM和T细胞的GVHD小鼠中,tdTomato+ T细胞(红色)竞争性地归巢到BM中,但减少了BM细胞移植;
(C)TMAO增强的T细胞浸润通过体外免疫荧光图像得到进一步证实;
(D)异基因受体脾脏tdTomato+ T细胞的出现频率逐渐增加;
(E)TMAO处理的受体中IFN- γ、IL-17、t -bet、STAT4、STAT3和RORγt在tdTomato+ T细胞中表达上调,而IL-4和STAT6无变化;
(F)TMAO处理分离的CD4+和CD8+ T细胞,GVHD相关转录因子和细胞因子的表达均未发现表达。

小结:TMAO对诱导异基因T细胞扩张以及Th1和Th17反应的影响不是在体外培养系统中观察的,而是在GVHD小鼠体内观察的。

4.氧化三甲胺在体内和体外均可增强巨噬细胞浸润并导致M1极化

从GVHD脾脏中筛选F4/80+CD11b+小鼠巨噬细胞和F4/80+CD11b+巨噬细胞中的CD16/32+ M1群体来研究巨噬细胞分化。

代谢组学
Figure 4. TMAO treatment enhanced macrophage infiltration and caused M1 polarization both in vitro and in vivo.

(A~B)与对照组相比,TMAO处理的GVHD小鼠的TCD-BM+T受体脾脏F4/80+CD11b+巨噬细胞显著增加;
(C)TMAO饲养的GVHD小鼠中具有M1表型(F4/80+iNOS+)的F4/80+巨噬细胞浸润更强;
(D~E)M1标志性细胞因子IL-6、CXCL9、CXCL10和IL-1细胞因子Nlrp3的表达在TMAO处理的GVHD小鼠脾F4/80+巨噬细胞中升高;
(F~G)TMAO刺激后,BMDMs中M1特征的IL-1β蛋白表达、IL-6、TNF-α, CXCL9和CXCL10的mRNA表达或蛋白生成均显著增加。

小结:TMAO可以诱导巨噬细胞向M1表型极化。

5.TMAO通过激活NLRP3炎症小体增强M1极化

M1极化的关键蛋白复合物NLRP3炎症小体是否参与了BMDMs对TMAO的反应。

代谢组学
Figure 5. TMAO enhanced M1 polarization via activating NLRP3 inflammasome. 

(A)在TMAO刺激下,分散在对照静息巨噬细胞内的ASC极化至核周区一侧;
(B)在TMAO处理的BMDMs中,始终可以诱导IL-1细胞裂解,而胆碱对NLRP3的表达和IL-1细胞裂解没有影响;
(C~F)NLRP3的抑制剂CY-09通过与NLRP3 NACHT结构域的ATP结合位点结合显著抑制TMAO相关的caspase-1裂解的产生和极化以及IL-1分泌。
(G)CY-09抑制TMAO诱导的M1标志性细胞因子或趋化因子的mRNA表达,包括IL-1β, IL-6, TNF-α, CXCL9 and CXCL10。
(H)Nlrp3-/-BMDMs并未显示M1表达增强,说明Nlrp3的激活在TMAO处理的巨噬细胞极化中起关键作用。

小结:NLRP3的激活在TMAO处理的巨噬细胞极化中起关键作用。

6.TMAO通过线粒体活性氧(ROS)激活NLRP3

线粒体功能障碍有助于NLRP3炎症小体的激活,接下来研究了TMAO对线粒体功能障碍的作用。

代谢组学
Figure 6. TMAO activated NLRP3 via mitochondrial reactive oxygen species (ROS).

(A~C)免疫荧光和流式细胞仪分析显示,TMAO处理后MitoSOX标记线粒体ROS增加;
(D)TMAO刺激导致JC-1红色荧光强度降低,绿色荧光强度增加,表明TMAO处理后线粒体膜电位下降;
(E)TMAO刺激的BMDMs中观察到功能失调线粒体的积累;
(F)NLRP3的产生却没有受到抑制;
(G~J)TMAO处理的巨噬细胞中,IL-1β蛋白和caspase1的产生被Mito-Tempo抑制;
(K~L)TMAO相关的M1巨噬细胞标志物细胞因子(TNF- a和IL-6)或趋化因子(CXCL9和CXCL10)的诱导被Mito-Tempo阻断。

小结:TMAO相关的M1巨噬细胞标志物细胞因子(TNF- a和IL-6)或趋化因子(CXCL9和CXCL10)的诱导被Mito-Tempo阻断。

7.NLRP3对于TMAO增强的GVHD是不可缺少的

进一步研究NLRP3在TMAO刺激的GVHD中的作用。

代谢组学
Figure 7. NLRP3 was indispensable for TMAO-enhanced GVHD.

(A)将缺乏NLRP3信号通路(NLRP3-/-)的小鼠作为受体进行小鼠建模;
(B)NLRP3的缺失显著延长了GVHD小鼠的生存曲线;
(C)表明TMAO不能诱导M1巨噬细胞极化当Nlrp3缺乏;
(D~E)这一发现与Nlrp3-/-GVHD受者回肠、结肠、皮肤和肝脏组织的组织学评分不变相关。

小结:通过促进TMAO使NLRP3上调是通过 NF-κB核易位实现的。

04
文章延伸

氧化三甲胺及代谢物参与机体多种重要的生物学功能,如渗透调压、稳定蛋白、防止蛋白变性、参与细胞分裂等。研究表明TMAO水平升高与心血管病呈现明显正相关,与高血压、心功能不全、动脉硬化等多种疾病密切相关,因此氧化三甲胺受到越来越广泛关注。Biotree 氧化三甲胺及相关代谢物高通量靶标定量可同时对6种物质进行绝对定量检测,有周期短、灵敏度高、定性定量准等特点。

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参考文献:
Wu KP, et al. Gut microbial metabolite trimethylamine N-oxide aggravates GVHD by inducing M1 macrophage polarization in mice. Blood 2020, doi:10.1182/blood.2019003990

文献下载:
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代谢组学