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文献分享 | 糖酵解代谢酶Aldob介导肝癌代谢重编程

分类:行业资讯   发布时间 2020-09-10   阅读: 96

代谢重编程是癌症的一个核心特征,但它在肝细胞癌(HCC)进程中仍缺乏明确的定义。之前的研究发现醛缩酶B(Aldolase B, Aldob)在肝癌组织中显著下调并且其表达与预后不良呈负相关,而代谢重编程环境下Aldob丢失的潜在机制仍基本未知。2020年7月,中国科学院上海营养与健康研究所在国际期刊Nature Cancer上在线发表题为“Aldolase B Suppresses Hepatocellular Carcinogenesis by Inhibiting G6PD and Pentose Phosphate Pathways”文章,发现Aldob通过直接结合和抑制磷酸戊糖途径中的限速酶葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)来抑制HCC,揭示了肝细胞癌中由于Aldob丢失而出现的一种新的代谢重编程模式,为肝癌治疗提供了一种潜在的治疗策略,下面来看看具体研究内容吧。


代谢流


研究人员首先对HCC病人组织进行基因芯片分析,发现除ALDOB外,大多数糖酵解和PPP基因在肿瘤和门静脉肿瘤血栓(PVTT)组织中显著上调,表明HCC代谢重编程。接着使用[U-13C6]葡萄糖跟踪新鲜人体组织中的代谢通量,发现来自糖酵解、三羧酸(TCA)循环和PPP的代谢物在肿瘤和PVTT中显著增加,并观察到Aldob的阶段依赖性下调和G6PD上调。在Kaplan-Meier分析中,Aldob高表达的患者比低表达的患者存活时间更长,而G6PD表达的患者则显示相反的趋势。此外,G6PD高表达、Aldob低表达患者具有最短的生存期,而G6PD低表达、Aldob高表达患者具有最长的生存期。进一步研究发现Aldob过表达抑制肿瘤细胞增殖,而Aldob敲除则促进肿瘤细胞增殖、葡萄糖消耗和乳酸生成。Aldob表达显著影响G6PD活性、氧化PPP代谢、耗氧量、糖酵解速率和细胞迁移,而不影响G6PD蛋白表达。这些数据表明Aldob通过抑制G6PD活性和PPP代谢来抑制肿瘤生长,Aldob的丢失可能会导致HCC代谢重编程的新模式(图1)。


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图1 | Aldob下调和G6PD上调与HCC患者较差的生存和预后相关

接下来,作者通过将二乙基亚硝胺(DEN)注射到喂食无果糖饮食的Aldob基因敲除(KO)小鼠体内,研究Aldob的抑瘤作用。在第40周,Aldob-KO小鼠的肝脏/体重比显著增加,肿瘤更多,肿瘤体积更大,肿瘤发病率高>5mm。非靶向代谢组学检测分析发现WT和Aldob-KO小鼠的肿瘤组织具有不同的代谢模式,果糖代谢和PPP途径受显著影响。在Aldob KO小鼠中氧化性PPP代谢物6PG和R5P,而不是非氧化性PPP代谢物S7P和E4P显著增加,与G6PD酶活性和GSH/氧化谷胱甘肽(GSSG)比率的增加一致。为了进一步支持肝脏Aldob的肿瘤抑制作用,作者在肝脏特异性KO(L-Aldob–/−)小鼠中通过腺相关病毒(Aldob AAV)恢复Aldob表达的研究发现与WT对照组小鼠(Aldobf/f+CK AAV)相比,肝脏特异性Aldob-KO对照组(L-Aldob–/−+CK-AAV)显著增加肝脏/体积比、肿瘤数量、最大肿瘤体积和肿瘤发生率>5 mm,而Aldob恢复组(L-Aldob–/−+Aldob-AAV)则显著抑制肿瘤生长和氧化PPP(6PG和R5P),此外,包括糖酵解、TCA和PPP在内的整个中心碳代谢也发生了显著变化。总之,肝脏Aldob通过抑制G6PD和氧化PPP代谢发挥肿瘤抑制作用,而Aldob的丢失释放G6PD以促进PPP代谢以维持肿瘤生长(图2)。


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图2 | Aldob通过调节肝细胞癌小鼠模型中G6PD活性和PPP代谢影响肿瘤发生

为了进一步支持通过Aldob的丢失释放G6PD活性来促进PPP从而促进HCC的假设,作者接下来通过在L-Aldob–/−中基因敲除G6PD或在Aldob KO小鼠中通过药物(G6PD抑制剂6-氨基烟酰胺(6AN)和脱氢表雄酮(DHEA))抑制G6PD活性来研究肿瘤的形成。分别与L-Aldob–/−对照组(L-Aldob–/−+ shNT AAV)和药物处理对照组(KO+溶剂)相比,G6PD基因敲除L-Aldob–/−小鼠(L-Aldob–/−+shG6PD AAV)和药物处理组(KO+抑制剂)均显著降低了肝脏/体积比、肿瘤数量、最大肿瘤体积和Ki67阳性细胞百分比,G6PD活性、6PG和R5P水平、NADPH生成和GSH/GSSG比率均显著降低。表明Aldob丢失诱导的G6PD和PPP代谢促进肿瘤发生,而抑制G6PD和PPP可减弱肿瘤发生(图3)。


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图3 |抑制G6PD减弱Aldob丢失诱导的肿瘤发生

作者利用免疫共沉淀、GST互作蛋白等实验验证Aldob结合并抑制G6PD活性,而Aldob的丢失有利于肿瘤形成这一假说,结果发现G6PD与Aldob具有直接的物理相互作用,而且Aldob结合和抑制G6PD的能力与Aldob酶活性无关。接着作者研究了Aldob–G6PD相互作用如何影响G6PD活性和细胞增殖,发现Aldob突变体几乎完全破坏了Aldob-G6PD相互作用,挽救了细胞生长。在二琥珀酰基转移酶(DSS)交联试验中,Aldob敲除显著增加活性G6PD二聚体的形成,表明Aldob丢失释放G6PD活性的抑制。总之,Aldob通过直接与G6PD结合来抑制G6PD活性;Aldob-G6PD相互作用的中断释放G6PD活性以促进细胞增殖。此外,Aldob对G6PD的支架作用比其酶活性更重要(图4)。


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图4 |Aldob通过与G6PD直接作用和抑制G6PD酶活性来抑制HCC肿瘤的发生

基于先前的研究表明肿瘤抑癌基因p53直接结合并抑制G6PD活性以及在不同Aldob表达小鼠中G6PD酶活性变化不同,作者推测p53可能参与了Aldob介导的G6PD抑制。研究了这三种蛋白质之间的相互作用,发现这三种蛋白相互作用形成稳定的Aldob-G6PD-p53蛋白复合物,而且Aldob的表达还以剂量依赖的方式显著增强了G6PD-p53的相互作用。接着作者研究了蛋白复合物对G6PD酶活性和细胞增殖的影响,发现单独的Aldob或p53显著增强了对G6PD活性和细胞增殖的抑制,而这两种蛋白的存在则具有加性抑制作用,在Aldob突变体中G6PD–Aldob相互作用的完全中断则恢复了G6PD活性和细胞增殖。总之,Aldob稳定了Aldob–G6PD–p53复合物,并增强了p53介导的G6PD和细胞增殖的抑制;Aldob的丢失或Aldob–G6PD相互作用的破坏导致Aldob–G6PD–p53复合物的不稳定性,并减弱了Aldob和p53对G6PD的抑制作用,导致PPP代谢上调,肿瘤的形成(图5)。


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图5 | Aldob通过稳定Aldob–G6PD–p53蛋白复合物抑制G6PD活性

作者使用几种葡萄糖示踪剂在不同的Aldob突变细胞中进行了代谢通量分析,研究Aldob如何通过Aldob–G6PD–p53复合物调节G6PD活性和PPP代谢。首先使用[1,2-13C2]葡萄糖来跟踪糖酵解和PPP代谢的分配,发现****酸和乳酸的M+1同位素以及PPP/GM在Aldob过表达细胞中显著降低,而在这三种Aldob突变细胞中不稳定的Aldob–G6PD–p53显著逆转了这些趋势,表明Aldob通过Aldob/G6PD/p53抑制PPP氧化代谢。其次使用[3-2H]葡萄糖跟踪代谢通量到PPP,基于不稳定氘通过G6PD转移到NADPH。结果发现Aldob过表达显著抑制了PPP代谢,而G6PD-Aldob相互作用的完全中断则恢复了PPP代谢。再次使用[1-2H]葡萄糖来测量[2H]标记的NADPH,以反映G6PD活性和PPP代谢,因为G6PD催化[1-2H]G6P生成[2H]NADPH。Aldob过表达抑制了2H进入NADPH,而破坏Aldob–G6PD–p53相互作用完全恢复了2H进入NADPH中,这表明Aldob–G6PD–p53复合物的不稳定释放了Aldob对G6PD活性的抑制。最后,使用[U-13C6]葡萄糖来检测G6P、6PG和R5P的产生,发现Aldob过表达导致标记的G6P、6PG和R5P显著减少,而在Aldob突变体中,这些影响减弱。作者通过原位肿瘤模型发现Aldob过表达显著延长小鼠存活时间,而完全破坏Aldob–G6PD相互作用则存活时间较短。此外,Aldob表达抑制肿瘤生长、肿瘤大小、体积和重量,而阻断Aldob–G6PD–p53相互作用可恢复相应的肿瘤变化。总之,Aldob通过与G6PD直接结合和稳定Aldob-G6PD-p53复合物,从而抑制G6PD活性和PPP代谢从而抑制肿瘤发生,显示了一种新的肿瘤抑制作用(图6)。


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图6 | Aldob通过稳定Aldob–G6PD–p53复合物抑制PPP代谢和肿瘤生长

小结:正常肝细胞中有足够的Aldob表达维持代谢稳态,并通过与G6PD和p53相互作用形成稳定的蛋白复合物(Aldob/G6PD/p53)来防止G6PD活性过度发挥。Aldob的丢失导致Aldob–G6PD–p53复合物的分解,释放G6PD并增强PPP代谢,以满足HCC进展的生物能量需求。研究揭示了肝内醛缩酶B(Aldob)在肝细胞癌糖代谢中起代谢开关的作用,因此,靶向Aldob介导的代谢重编程途径可能是肝癌防治的一种潜在治疗策略。

文章延伸

文章使用了代谢流示踪技术研究了糖酵解代谢酶Aldob介导肝癌代谢重编程机制。BIOTREE提供靶标代谢流分析,为您的科学研究助力。

靶标代谢流分析(Metabolic Flux Analysis,MFA),通过向细胞中添加13C或者15N同位素标记的底物,使用质谱法测量下游代谢物中出现的同位素掺入模式,进行代谢流研究,可以得到标记底物在代谢网络中的代谢流向和分布,能够系统地定量细胞或者组织内特定代谢通路代谢网络的流量分布及各代谢途径的相对贡献。


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Systems-level analysis of isotopic labeling in untargeted metabolomic data by X13CMS. Nature protocol, 2019

示踪剂:如13C标记的Glucose,为代谢反应提供13C碳源 

被标记的代谢中间体:如Citrate,既可使用葡萄糖也可以使用谷氨酰胺作为碳源,如果葡萄糖被13C标记,通过追踪同位素便可得知其对柠檬酸合成的贡献

应用方向

通过比较不同环境条件及各种代谢性疾病的不同代谢途径的代谢流量的分布变化,揭示出相关疾病发生发展过程中的主要代谢通路及其早期诊断的标志物;

通过13C代谢流量技术对胞内外的中间代谢物的变化示踪,可以鉴定出基因工程菌的关键的代谢通路和活性,为提高目标代谢产物的合成提供直接的依据;

可以比较分析细胞、组织及其血样和尿液在基因改造的前后的代谢功能变化。

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参考文献:
Min Li, Xuxiao He,Weixing Guo,et al.Aldolase B suppresses hepatocellular carcinogenesis by inhibiting G6PD and pentose phosphate pathways. Nature Cancer,2020

文献下载:
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