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Science重磅发表蛋白质组黄金CP-深度TMT蛋白质组+磷酸化蛋白质组:机体昼夜节律调节因子的新发现

分类:行业资讯   发布时间 2020-09-15   阅读: 92


蛋白质组学


文献ID:Circadian rhythms in the absence of the clock gene Bmal1
发表期刊:Science
发表日期:2020-02-14
影响因子:41.845
样本类型:小鼠皮肤成纤维细胞(MSFs)、肝组织
样本数量: 发现集(n=10),验证集(n=10) 
主要技术:TMT-10plex标记蛋白质组、磷酸化蛋白质组、转录组
搜库软件:MaxQuant(version 1.5.2.8)

01
研究背景

昼夜节律(约24小时)在调节日常生理方面起着重要作用。转录因子Bmal1是哺乳动物生物钟的主要驱动因子,是作为机体主要的分子计数器的关键部分。但美国宾夕法尼亚大学Akhilesh B. Reddy发现,通过深度TMT蛋白质组、磷酸化蛋白质组和转录组学研究,在Bmal1基因敲除小鼠中,即使没有外界刺激(如光或温度的变化),其也会影响身体的周期变化,预示着生物时钟的其他驱动因素也是存在的。

02
研究成果

1.Bmal1基因敲除小鼠中的肝脏组织和成纤维细胞表现出昼夜节律性振荡

作者使用糖皮质激素-地塞米松(DEX)同步小鼠肝脏组织和皮肤成纤维细胞(MSFs),然后同步48小时后在恒定条件下取样。在Bmal1-/-的MSFs中检测到了节律性表达基因。其在Bmal1-/-Bmal1+/+肝组织中具有相似的振幅分布。此外,观察到振幅分布与使用野生型小鼠进行的早期昼夜转录组研究的振幅分布相当。正如所预期的,与两种基因型的成纤维细胞相比,肝组织中节律性转录基因的振幅更高。 
蛋白质组学
图1  Bmal1-/-小鼠肝组织和皮肤成纤维细胞的节律转录组

2.ETS转录因子、PRDX蛋白和通过Trp53和Sirt1介导的时钟组成之间存在多重相互作用,它们是昼夜节律时钟基因表达的重要调节因子

是什么潜在的分子机制驱动了大脑组织的昼夜节律性?为了研究这一点,作者分析了节律性表达转录基因的启动子区(FDR < 0.1),无偏基序分析表明E26转录因子(ETS)和KLFs或特异性蛋白(Sp)转录因子基序分别在黎明和黄昏阶段富集。发现了多个具有相似峰期的ETS转录因子的表达聚集在一起。此外,siRNA敲除PRDX蛋白也影响有核U2OS细胞的昼夜节律。
蛋白质组学
图2  Bmal1-/-组织中ETS转录因子和PRDX蛋白的24小时节律性

3.MSFs和肝组织的深度TMT蛋白组磷酸化蛋白组联合分析,揭示即使在没有Bmal 1的情况下,翻译后过程也是组织节律性的关键调节因子

据已有报道,野生型小鼠体内存在昼夜蛋白质组和磷酸蛋白质组,但是不在Bmal1-/-组织中,因而作者研究了这种节律性是否延伸到Bmal1-/-小鼠的蛋白质组和磷酸化蛋白质组水平。作者将MSFs和肝组织按照不同时间点(野生型组和Bmal1-/-组)进行标记,每种样本类型分别用两套TMT-10plex试剂盒将其分为发现集和验证集。发现集包括十个偶数时间点(CT0、CT6、CT12、CT18、CT24、CT30、CT36、CT42、CT48、CT54),而交替的奇数时间点(CT3、CT9、CT15、CT21、CT27、CT33、CT39、CT45、CT51、CT57)在验证集中进行分析。肽段处理过程中,10%的TMT标记的肽用于深度蛋白质组学分析,而其余90%进行磷酸化肽富集,用于磷酸化蛋白组实验。使用TiO2进行磷酸化肽的富集。

在MSFs和肝组织的野生型组和Bmal1-/-组中,都检测到了与节律相关的表达蛋白质和磷酸化修饰蛋白。在MSFs的野生型组中检测到585个节律蛋白,Bmal1-/-组中检测到364个节律蛋白,两种基因型的蛋白节律峰相位相当。与节律性转录组结果相似,在野生型和Bmal1-/-细胞中发现的环状蛋白和磷酸化修饰蛋白之间的重叠最小。正如预期,与节律相关的磷酸化蛋白振幅比两种基因型的常规蛋白都高。
蛋白质组学
图3  BMAL1缺失时的节律蛋白质组和磷酸化蛋白质组

4.与节律相关的转录基因和蛋白质在Bmal1敲除动物中的功能是多样的

与野生型相比,Bmal1-/-显著富集的生物过程包括代谢、细胞内转运和氧化还原。此外,GO分析发现,特定的细胞成分过多,特别是线粒体及其不同的亚细胞。与这些观察结果一致,有报道称Bmal1功能对线粒体分裂、融合动力学和肝脏呼吸功能很重要。
蛋白质组学
图4  在Bmal1-/-小鼠中线粒体GO条目的过表达

03
研究结论

尽管Bmal1对于24小时行为周期的表达是必需的,但是它对于转录、翻译和翻译后修饰蛋白水平的24小时分子节律不是必需的,翻译后过程也是组织节律性的关键调节因子。

04
文章亮点

生物体的调控网络非常复杂,单一组学的研究具有一定的局限性。蛋白组只能反映表达水平的物质变化,而蛋白翻译后修饰(PTM)可以展示修饰水平的物质变化。只进行其中某一层面的检测,不能真实地探究到底是表达还是修饰起到了关键的作用。所以深度TMT蛋白组和修饰蛋白组的联合分析,可以实现更加全面,精准的研究目的。

05
文章延伸

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