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【Plant Physiology】101种植物激素绝对定量的方法是怎么做到的?

分类:行业资讯   发布时间 2020-10-16   阅读: 92

植物激素是一种具有重要生理作用的小分子,在调节植物各种生理过程的复杂信号网络中起着重要作用,一般来说,它们在植物组织中的浓度非常低,如何准确定量地检测植物激素便成了大家关注的焦点。

今天给大家分享一篇发表在 Plant Physiology上的文章:Plant Hormonomics: Multiple Phytohormone Profiling by Targeted Metabolomics。这篇文章详细介绍了101种植物激素绝对定量的方法。希望本文的分享能够给大家带来些许启发。


代谢组学


01
样本处理

文章采用一步提取法结合SPE固相萃取柱前处理方法,结合HPLC-ESI-MS/MS方法正负模式共测定101种植物激素,作者研究了油菜素内酯类物质在不同比例的乙腈中的溶解度(图一A),同时在这些不同比例的乙腈中叶绿素a与叶绿素b的含量(图一B),最终提取液选择50 %乙腈溶液,作者同时测试不同分类待测物质在酸性与碱性条件下的稳定性来确定是否添加其他酸碱添加剂(图一C),作者查询了之前的文献报道,为了降低基质效应的同时防止步骤过于繁琐,作者选择通过单个SPE固相萃取柱,具体样本预处理过程见图一D。



图一 样品制备的优化

02
色谱分离

本篇文章共分离101种植物激素,这些植物激素有许多是同分异构体,质谱检测器无法分离,需要靠色谱使其基线分离,高效色谱柱当前更新速度较快,作者从中选取RP ultra-HPLC (UHPLC)配合charged-surface hybrid (CSH)保护柱与ethylene-bridged hybrid (BEH) polymer-based sub-2-μm sorbent色谱柱进行比较,通过IAA-Asp与IAA-Glu在两根柱子上的峰形表现最终确定使用RP ultra-HPLC (UHPLC)配合charged-surface hybrid (CSH)保护柱(图二A),作者根据以往的文献得知随着流动相中甲酸浓度的升高对CK类植物激素的物质分离有损害,作者用等度洗脱测试了甲酸浓度梯度为0.001 %,0.01 %与0.1 %,最终选用甲酸浓度为0.01 %作为流动相,它的色谱图见图二B,作者经过测试,如果采用正负切换模式,负离子的响应会降低4-12倍,所以作者采用两次进样,分别测试正离子模式与负离子模式,图二C为正离子模式的TIC叠图,图二D为负离子模式TIC叠图。


代谢组学

图二 色谱分离基线的优化

03
方法验证

为了验证方法的可靠性,作者验证了:

1. 加标回收率:向样本中加入已知浓度的目标分析物,通过对未加标样本与加标样本的样本处理后上机,用加标样本的浓度减去样本内源含量,与已知加标浓度比算出加标回收率,经过作者处理后加标回收率偏差的范围是5.2 %-8.68 %;

2. 精密度:重复三次上机,计算浓度的相对标准偏差,精密度范围是1.06 %-7.8 %;

3. 重复性:目标分析物分为低、中、高三个等级,浓度在四个数量级,每个浓度等级样本在连续三天内重复进样三次,计算每个浓度等级的相对标准偏差,作者对101个目标化合物进行测试,相对标准偏差低于15 %;

4. 日间精密度与日内精密度:通过评估一系列重复样品的分析结果的密闭性来量化分析方法的日内和日间精密度,日内精密度0.6 %-10.5 %,日间精密度1.3 %-17.3 %。

04
方法适应性

为了验证方法适应性,作者测试了拟南芥的根与茎受盐胁迫与对照组中激素相关的转录物和代谢物水平,对已发表的微阵列数据集进行筛选,以确定一种刺激会影响涉及大多数植物激素代谢途径的基因。图三A为简化版植物激素合成通路。作者设计的实验是采用12 d的拟南芥幼苗在含有和不含有150 mm的NaCl媒介中培养48 h,分别采样后按照样品处理步骤处理后上机检测,图四A显示整个过程的插图,图三B显示盐胁迫与对照组植物激素变化。

通过比较转录组数据,进一步交叉验证了激素组结果(图三C和D)和激素分布图(图四E和F)。这些发现表明,对刺激(如盐度)的生理反应不是仅仅由一种激素的单一活性形式(甚至是几种激素的单一活性形式)控制的,而是由多种激素、代谢物和基因的活性和比例组合控制的。作者通过的激素组分析和与转录组数据的交叉验证强调了这种分析方法的价值,它提供了强有力的工具,不仅评估转录水平,而且能够测定在样本中相应代谢物的水平,从而获得激素反应和相互作用的全局观点。


代谢组学
图三 盐胁迫诱导拟南芥中植物激素相关基因表达水平的变化

代谢组学
图四 盐胁迫下拟南芥根和芽与对照植物激素的比较

05
小结

作者通过采用液相色谱串联质谱的方式,使用Acquity UPLC CSH C18 RP column (150 × 2.1 mm,particle size of 1.7 μm)柱,对101种植物激素进行绝对定量检测,通过验证加标回收率、精密度、重复性等确保方法稳定可行,并通过研究盐胁迫激素组分析与转录组数据交叉验证,强调了方法的价值。

文章延伸

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代谢组学