英文标题：Ammonia-induced lysosomal and mitochondrial damage causes cell death of effector CD8⁺T cells

中文标题：氨诱导的溶酶体和线粒体损伤导致效应 CD8⁺T细胞死亡

发表期刊：nature cell biology

影响因子：17.3

氨作为细胞代谢的有毒副产物，长期以来被认为与肝衰竭导致的高氨血症及神经损伤密切相关。然而，其在肝外组织中的生理病理作用尚不明确。CD8⁺T_eff细胞在对抗病原体或肿瘤过程中快速增殖，这一过程依赖谷氨酰胺分解代谢提供能量，但同时产生大量氨。传统观点认为，肝外细胞通过尿素循环以外的途径清除氨，但快速增殖的T细胞是否因氨积累导致功能损伤或死亡仍未知。此前研究发现，记忆T细胞通过尿素循环解毒氨以维持存活，但效应T细胞因缺乏关键酶CPS1可能无法有效清除氨。本研究首次揭示氨通过溶酶体-线粒体互作诱导T细胞死亡的新机制，为优化T细胞免疫治疗提供了理论依据。

1、氨诱导CD8⁺T_eff细胞死亡

为验证氨积累是否直接导致效应T细胞死亡，先将 CD45.1⁺OT-I T细胞过继转移至CD45.2⁺小鼠体内，随后用表达OVA的李斯特菌(Listeria monocytogenes expressing ovalbumin, Lm-OVA)感染这些小鼠，利用靶向代谢组学技术动态检测细胞内氨水平，同时使用流式细胞术监测细胞存活。结果显示：感染后第12天，效应T(T_eff)细胞内氨水平达峰值，细胞死亡比例显著升高（图1a-c）。体外使用SIINFEKL肽刺激后，OT-I T_eff细胞自第 10天起氨水平开始上升，随后出现细胞死亡，而培养基中始终未检测到氨（图1d-e）。外源性NH₄Cl处理进一步加速细胞死亡（图1f），氨甲酰磷酸合酶1(Carbamoylphosphate synthase 1, CPS1)可减轻CD8⁺记忆T细胞的氨中毒，但在CD8⁺T_eff细胞中未检测到CPS1表达（图1g）。¹⁵N标记的 NH₄Cl示踪实验也证实，细胞中m+1氨甲酰磷酸无显著增加（图1h）。过表达CPS1后，细胞内氨甲酰磷酸及尿素循环代谢物显著增多，同时T_eff细胞的尿素生成量增加（图1i-j）。此外，CPS1过表达或4-苯基丁酸(4-Phenylbutyric acid, 4PBA)处理均可有效降低氨水平并挽救细胞存活（图1k-n）。形态学观察显示，死亡的CD8⁺T_eff细胞在收缩期出现独特的胞质空泡，该特征在其他类型细胞死亡中未被观察到（图1o）。细胞内ATP水平检测表明，晚期活化或氨处理的CD8⁺T_eff细胞ATP生成显著减少（图1p-q）。综上，本研究证实氨积累可诱导效应CD8⁺T细胞发生独特形式的死亡。

2、谷氨酰胺衍生的氨有助于效应T细胞死亡

为明确T_eff细胞氨代谢来源及调控靶点，研究者利用¹⁵N标记谷氨酰胺示踪，并以谷氨酰胺酶1（Glutaminase 1, GLS1）抑制剂及无谷氨酰胺培养基处理。结果显示：GLS1抑制剂显著降低氨水平，提升T_eff细胞存活率（图2b-c）；同位素示踪表明，Lm-OVA感染8天后，¹⁵N标记的谷氨酰胺在 CD8⁺T_eff细胞积累（图2d-e），且¹⁵N同位素体存于鸟苷一磷酸等代谢物中，提示早期氨用于合成代谢，后期非分裂状态下氨积累（图2f-h）。感染第1天抑制GLS1不影响氨水平，但阻碍OT-I T_eff细胞增殖（图2i-k）；敲除GLS1后，细胞数量增加、氨水平下降，感染8天谷氨酰胺在CD8⁺T_eff细胞内积聚（图2l-o）。综上，谷氨酰胺是诱导CD8⁺T_eff细胞死亡的氨主要来源。

3、氨通过RHCG转运至溶酶体引发功能损伤

利用免疫荧光定位RHCG（氨转运蛋白），并检测溶酶体pH、膜通透性及蛋白酶活性。结果显示，体内外T_eff细胞中溶酶体氨水平随时间上升，细胞死亡时达峰值（图3a）；L-谷氨酰胺-¹⁵N₂示踪证实溶酶体氨源于线粒体（图3b）。抑制GLS1可降低OT-I T_eff细胞溶酶体铵水平（图3c），铵积累伴随溶酶体pH升高（图3d）。活化12天的T细胞中，组织蛋白酶B/D、β-半乳糖苷酶及α-甘露糖苷酶活性下降，溶酶体膜透化(LMP)增加（图3e-f），该损伤可被GLS1抑制剂逆转（图3g-i）。

通过敲除/过表达氨转运蛋白发现，CD8⁺T_eff细胞高表达RHCG，晚期活化细胞溶酶体中RHCG显著增加（图3j-k）。敲低RHCG降低溶酶体氨水平，过表达 RHCG虽未增加胞外氨，但显著提升溶酶体氨含量，同时降低线粒体氨水平（总氨量不变）（图3l-n），并加速CD8⁺T_eff细胞死亡，该效应可被GLS1抑制剂阻断。此外，RHCG过表达导致溶酶体pH升高、膜透化加剧及酶活性降低，而JHU083可恢复溶酶体功能（图3q-s）。这些结果表明，排出的氨通过RHCG转运到溶酶体中。

4、氨滞留导致线粒体损伤

为探究氨在线粒体滞留的效应，研究人员利用透射电子显微镜观察线粒体超微结构，并开展CPS1过表达或GLS1抑制剂干预实验。结果显示：刺激后第8天，T细胞线粒体氨水平显著升高（图4a）；体内外晚期CD8⁺T_eff细胞均出现线粒体膜电位降低（图4b）。尽管早期与晚期T_eff细胞线粒体数量无差异，但晚期细胞中线粒体DNA拷贝数显著减少（图4c-d），且线粒体形态呈现明显损伤（图4e）。为验证线粒体损伤与氨滞留的因果关系，通过体内过表达CPS1降低氨水平，或使用GLS1抑制剂减少过继转移OT-I细胞的氨生成。结果表明，两种干预均有效挽救线粒体损伤（图4f-k）。综上，线粒体氨滞留可引发严重的线粒体结构与功能损伤。

5、受损的线粒体不能通过自噬清除

为解析溶酶体-线粒体互作在氨诱导死亡中的机制，研究通过WB检测LC3-II/p62表达，利用免疫荧光观察自噬体-溶酶体共定位，并使用溶酶体酸化剂 C381干预。

电子显微镜观察显示，CD8⁺T_eff细胞内线粒体样结构极少（图5a），且TEN刺激未引起PINK1和 Parkin蛋白水平变化（图5b）。LC3荧光斑点与线粒体的共定位分析表明，虽第12天LC3斑点增多，但在第4天和第12天的T_eff细胞中均未检测到两者共定位（图5c），提示线粒体自噬及巨自噬过程受损。

进一步发现，感染后期T_eff细胞中LC3-II持续积累，但p62未降解，证实自噬体-溶酶体融合障碍（图5d-e）；电镜下可见单层膜自溶体数量显著增加，内含未完全降解的细胞质成分及线粒体嵴碎片（图5f-g）。而C381处理可显著降低体内外活化的OT-I T_eff细胞死亡率（图5h-i）。综上，溶酶体pH升高在氨诱导的T_eff细胞死亡中起关键作用，受损线粒体无法通过自噬途径有效清除，或为该死亡模式的重要特征。

6、氨死亡阻断增强癌症的过继性T细胞治疗

为验证干预氨死亡通路对肿瘤免疫治疗的增效作用，研究构建B16-OVA黑色素瘤小鼠模型，将OT-I T_eff细胞过继转移至荷瘤小鼠，随即联合GLS1抑制剂或溶酶体酸化剂C381进行治疗，并动态监测肿瘤体积及T细胞浸润情况。结果显示，过继转移后第4-10天，肿瘤浸润的OT-I细胞出现氨积聚，伴随溶酶体pH值显著升高（图6a-c）。经GLS1抑制剂处理14天后，肿瘤生长明显受限，小鼠生存期显著延长（图6d-g）；进一步分析证实，这与肿瘤、淋巴结、脾脏和肺部中转移细胞数量增多的情况相一致（图6h）。机制层面，GLS1抑制剂可降低肿瘤浸润OT-I细胞的溶酶体pH值及膜透化程度，同时恢复溶酶体酶活性（图6i-k）。此外，通过过继转移携带诱导型GLS1 shRNA的OT-I T_eff细胞，或过表达CPS1的OT-I T细胞至荷瘤小鼠，均观察到肿瘤生长减缓、小鼠生存期延长（图6l-n、p-s），且肿瘤微环境中OT-I T_eff细胞数量显著增多（图6o）。综上，阻断氨死亡通路可通过改善T细胞在肿瘤微环境中的持久性，显著增强过继性T细胞治疗的抗肿瘤效果。

本研究首次揭示氨通过“溶酶体碱化-线粒体损伤-自噬受阻”级联反应诱导效应T细胞死亡的新机制，命名为“氨死亡”。这一发现不仅拓展了细胞死亡的类型认知，更为提高T细胞免疫治疗疗效提供了新策略：通过干预谷氨酰胺代谢或调节溶酶体微环境，可有效维持T_eff细胞存活及功能，为实体瘤治疗开辟了全新方向。