胃癌(Gastric cancer, GC)是全球第五大常见癌症，也是导致癌症死亡的主要原因。幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, H. pylori)是胃癌的主要危险因素，被列为I型致癌物。但在感染幽门螺杆菌的个体中，只有1%-3%的人最终发展为GC，这表明还有其他因素参与其中。一些新的证据表明，大量的非H. pylori微生物群存在于胃粘膜中，它们的失控可能在胃癌发生中起作用。然而，与胃癌发生相关的非H. pylori驱动细菌尚未被发现。

2024年1月30日，香港中文大学于君老师团队在Cell在线发表题为"Streptococcus anginosus promotes gastric inflammation, atrophy, and tumorigenesis in mice"的研究论文，该研究发现GC患者胃粘膜中有丰富的咽峡炎链球菌(Streptococcus anginosus, S.anginosus)。S.anginosus定植于小鼠胃并引起急性胃炎。在常规小鼠模型中，S.anginosus感染可诱发进行性慢性胃炎、壁细胞萎缩、粘液化生和异型增生，并在无菌小鼠中得到证实。此外，在致癌物诱导的胃肿瘤形成和YTN16 GC细胞同种异体移植中，S.anginosus加速了GC进展。S.anginosus可破坏胃屏障功能，促进细胞增殖，抑制细胞凋亡。作者进一步进行了机制研究，采用Pull-Down实验来确定S.anginosus与宿主受体结合的细菌粘附素，通过质谱检测到三种蛋白并找到关键膜蛋白TMPC（百趣生物为其提供蛋白质谱检测服务），TMPC可与胃上皮细胞上的膜联蛋白Annexin A2(ANXA2)受体相互作用。TMPC与ANXA2相互作用诱导丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)活化。ANXA2基因敲除后，S.anginosus对MAPK的诱导作用被阻断。本项研究揭示了S.anginosus是一种病原体，通过与TMPC-ANXA2-MAPK轴上的胃上皮细胞直接相互作用而促进胃肿瘤的发生。

1、 胃炎患者胃粘膜中富含S.anginosus

作者首先采用自己内部的16S rRNA基因测序数据集分析了胃癌发生的不同阶段中S.anginosus的丰度。与浅表性胃炎(superficial gastritis, SG, N=110)相比，萎缩性胃炎(atrophy gastritis, AG, N=117)和肠化生(intestinal metaplasia(IM, N=45)患者的S.anginosus水平明显升高，在GC(N=39)患者中达到最高水平（图1 A）。S.anginosus对胃部感染长期影响，通过动物模型实验，将感染模型延长到3、6、9和12个月，结果发现 S.anginosus感染小鼠3个月后诱发慢性胃炎（图1 B和C）。

图1 S.anginosus在不同类别胃活检样本中的丰度分布图及其染促进小鼠慢性胃炎

2、 S.anginosus诱导小鼠产生胃炎萎缩化生异型增生序列

胃肿瘤的发生过程沿着萎缩-化生-异型增生序列的癌前病变进行，胃炎是一个主要的危险因素。既然S.anginosus可诱发慢性胃炎，那么作者思考：长期感染是否会引发胃粘膜的癌前病变。通过研究发现，在感染9个月时，S.anginosus感染引起轻度壁细胞萎缩，12个月时发展为中度至重度萎缩(p=0.01)，并检测到粘液化生，形成了低级别的不典型增生（图2 A~D）。对小鼠胃组织的荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization, FISH)分析表明，与非化生区相比，S.anginosus在化生/异型增生区域中较为丰富。以H. pylori为阳性对照，H. pylori可更快地引起胃萎缩；但是在12个月时，粘液化生的数量低于S.anginosus诱导的，并且没有发现异型增生（图2 A、B和E）。在感染9个月和12个月后，与BHI对照组相比，S.anginosus引起胃萎缩(P<0.05)。为了确证粘液化生，作者进行了阿尔新蓝的组织学染色，这是一种常用的指示胃中杯状细胞的染料，用于诊断IM。在12个月龄时，感染链球菌的小鼠胃粘膜内可见阿尔辛蓝阳性细胞，而BHI对照组小鼠胃粘膜内未见阿尔辛蓝阳性细胞。作者还进行了化生标记物单叶格里夫尼亚凝集素II(Griffonia simplicifolia lectin II, GSII)的免疫荧光染色（图2 F）。与H&E染色下的化生改变一致，感染后12个月，胃腺内GSII阳性细胞增加。

图2 S.anginosus引起小鼠胃萎缩、化生、异型增生

3、 S.anginosus促进胃肿瘤的发生

作者通过建立N-甲基-N-亚硝脲(N-methyl-N-nitrosourea, MNU)诱导的GC小鼠模型（图3 A）来阐明S.anginosus在胃肿瘤发生中的作用。结果表明：MNU处理9个月后，胃窦部出现胃部病变。感染S.anginosus的小鼠肿瘤发生率(10/11)显著高于对照组(4/13)和幽门螺杆菌感染小鼠(12/18，P<0.003)（图3 B）。与只接受MNU处理的对照小鼠相比，感染S.anginosus的小鼠的肿瘤数量(p=0.006)和肿瘤大小(p<0.05)都显著增加（图3 C）。组织学检查显示，36.4%的小鼠有高度不典型增生(high-grade dysplasia, HGD)，高于单独接受MNU处理的小鼠(15.4%)(图3 D)，与H. pylori感染的小鼠（22.2%HGD和5.6%腺癌）相当。Ki-67染色显示，与MNU处理的对照小鼠相比，S.anginosus的小鼠细胞增殖更高(p<0.05)（图3 E）。这些发现共同推断，S.anginosus加速了MNU诱导的小鼠胃肿瘤的发生。

图3 S.anginosus加速小鼠胃癌的发生

4、TMPC-Annexin A2轴介导S.anginosus定植并激活MAPK信号转导

在小鼠胃粘膜中发现了S.anginosus的定植后，接着对该细菌的黏附特性进行了研究。通过细菌附着和入侵法以及扫描电子显微镜(scanning elec-tron microscopy, SEM)发现，S.anginosus （<1 μm，球状）附着在AGS和GES-1细胞表面，具有清晰的病原-宿主界面。这表明S.anginosus可能通过与胃上皮细胞直接相互作用而发挥致癌作用。

进一步通过biotin-pull-down、GST-pull-down，COIP等互作实验以及sgRNA细胞实验对S.anginosus附着和侵袭胃上皮细胞的潜在机制进行研究，发现和证实了S.anginosus通过其表面蛋白TMPC与胃上皮细胞上的ANXA2受体结合，介导S.anginosus对胃上皮细胞的定植，在肿瘤发生中起重要作用（图4 A~G）。

为了进一步研究S.anginosus诱发胃癌的下游信号机制，作者对感染S.anginosus的普通小鼠（12个月）和对照组小鼠的胃组织进行了rna-seq测序以及WB验证等实验，最终发现和证实了S.anginosus通过TMPC-ANXA2相互作用促进MAPK信号转导，进而引起了其在胃上皮细胞中的促癌作用（图4 L~Q）。

图4 S.anginosus通过TMPC-ANXA2轴激活MAPK信号通路促进胃肿瘤的发生

综上所述，作者鉴定了一种非H. pylori驱动细菌S.anginosus会促进胃肿瘤的发生。在小鼠模型中，S.anginosus感染诱导胃炎和癌前病变、萎缩化生-异型增生序列，并加速胃肿瘤的发生。进一步发现了S.anginosus表面毒性因子TMPC与胃上皮细胞表面的ANXA2结合，引起细菌的附着、侵袭，以及致癌基因MAPK信号的下游激活。本项研究提供了S.anginosus在胃癌发生过程中作为致病病原体的证据。