文章标题：Metformin attenuated sepsis-related liver injury by modulating gut microbiota
发表期刊：Emerging Microbes & Infections
影响因子：19.568
作者单位：郑州大学第一附属医院
百趣生物提供服务：16S rRNA测序
本研究评估了二甲双胍是否可以通过调节脓毒症老年大鼠的肠道微生物群来减轻肝脏损伤。采用盲肠结扎穿刺(CLP)诱导老年大鼠肝脏损伤（SLI）。粪便菌群移植(FMT)用于验证肠道微生物群在肝损伤病理中的作用。采用16SrRNA测序方法分析肠道菌群的组成；通过组织病理学、免疫荧光、免疫组化和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)对肝脏和结肠组织进行分子表型研究。结果表明，二甲双胍不仅能改善老年脓毒症相关性肝损伤大鼠的肝损伤、结肠屏障功能障碍，还能减轻脓毒症诱导的肝脏炎症和肠道微生物群的失衡。此外，二甲双胍处理的SLI大鼠粪便FMT组表现出更轻的肝损伤和结肠屏障功能障碍。研究结果表明，二甲双胍可能通过调节脓毒症老年大鼠的肠道微生物群和减轻结肠屏障功能障碍来改善肝损伤，这可能是治疗SLI的有效方法。
脓毒症（Sepsis）是全球重要的公共卫生问题之一，其特点是严重的炎症和异常的免疫反应，导致危及生命的器官功能障碍、高发病率和高死亡率。郑大一附院综合ICU孙同文教授团队长期致力于脓毒症的发病机制、防治策略研究，发现二甲双胍（Metformin）治疗脓毒症患者预后较好，但其机制不详。肝脏是平衡宿主稳态和调节宿主防御作用的重要器官，肠肝轴成为脓毒症中肠道菌群的关键“靶”器官，并且脓毒症相关的肝损伤与较高的死亡率相关。研究报道，胃肠道中的微生物群可以远程调节多器官损伤。肠道微生物群失调增加了脓毒症和死亡的风险，肠道微生物群调节免疫活性的上游，并参与脓毒症的进展。本研究通过粪菌移植（FMT）以及16S rRNA基因测序等实验发现二甲双胍干预可改善老年脓毒症大鼠肠道菌群紊乱和肠道屏障功能障碍，减轻脓毒症相关的肝损伤。
01
二甲双胍可减轻脓毒症老年大鼠盲肠结扎和穿刺(CLP)诱导的肝脏炎症和损伤
为了检测CLP诱导的脓毒症引起的老年大鼠的肝脏炎症和损伤，作者在CLP诱导24h后的肝脏中进行了组织学和RT-PCR检测。与SC组相比，CLP组肝切片H&E检查显示肝小叶破坏、炎症浸润和肝出血。CLP组的肝细胞凋亡显著增加，而二甲双胍治疗显著降低了脓毒症诱导的肝细胞凋亡。同时肝脏炎症因子和趋化因子以及血清生化参数也表明二甲双胍可减轻脓毒症老年大鼠的炎症和肝损伤。
02
二甲双胍对脓毒症老年大鼠结肠炎症和肠屏障的影响
结肠切片进一步检查显示结肠炎症，CLP组结肠黏膜被侵蚀，腺体无序变形，紧密连接结构模糊，炎症细胞浸润广泛，并伴有隐窝脓肿。然而，与CLP组相比，CLP-MET组大鼠有完整的结肠上皮、正常的腺体，炎症细胞浸润较少(图2(A，B))。这提示CLP诱导的脓毒症可严重损害结肠黏膜，二甲双胍治疗可显著降低这种损伤。另外二甲双胍增加了claudin-3的表达(图2(C，D))。综上所述，二甲双胍治疗可增加老年SLI大鼠紧密连接蛋白的表达，减少肠漏和炎症反应。
图2. 二甲双胍对老年大鼠结肠炎症和肠屏障的影响。(A，B)H&E染色显示，与SC组和SC-MET组相比，CLP组结肠组织炎症浸润、水肿和出血明显增加，而CLP-MET组这些异常有所改善。(C，D)claudin-3蛋白表达的IHS表达结果。
03
二甲双胍介导肠道微生物群的敏感性影响肝损伤
肠道微生物群可能是宿主对多微生物脓毒症反应的重要调节因子，作者假设二甲双胍通过介导肠道微生物群来改善肝损伤并通过FMT实验验证。根据粪便微生物群移植（FMT）后的组织学分析和伤害评分量化结果来看，移植二甲双胍处理肠道菌群的大鼠比移植CLP处理的大鼠发生的肝损伤更轻。
图3. 二甲双胍对SLI的影响是通过影响肠道微生物群的敏感性来传播的。(A)FMT实验设计图。(B，C)供体和处死大鼠肝脏的H&E染色和组织学评分。(D，E)供体和处死大鼠的肝脏TUNEL值测定和定量分析。(F-J)RT-PCR实验显示，与CLP-MET组和FMT-MET组相比，CLP组和FMT-CLP组中炎症因子TNF-α、IL-6、趋化因子ccl2、cxcl1和ccl4的表达均升高。
作者观察到与CLP-MET组和FMT-MET组相比，CLP组和FMT-CLP组中炎症因子TNF-α、IL-6、趋化因子ccl2、cxcl1和ccl4的表达均升高。更重要的是，与FMT-CLP组相比，FMT-MET组结肠黏膜侵蚀改善，腺体无序变形，紧密连接结构模糊，浸润的炎症细胞改善(图4A，B)。FMT-MET组结肠组织中紧密连接蛋白claudin-3的表达显著增加(图4C，D)。综上所述，二甲双胍减轻肝损伤的效果可以通过影响肠道微生物群来实现。
图4. FMT实验中二甲双胍对结肠炎症和肠屏障的影响。(A，B)H&E染色显示，与CLP-MET和FMT-MET组相比，CLP和FMT-CLP组结肠组织炎症浸润、水肿和出血显著增加。(C，D)claudin-3蛋白表达的IHS表达结果。
图5. 二甲双胍对老年大鼠肠道菌群多样性的影响。(A，B)16SrRNA基因测序分析显示，与SC组相比，CLP组肠道微生物群的alpha多样性如cha1和Shannon指数显著降低，而CLP-MET组的alpha多样性相反。(C，D)肠道微生物区系的Beta多样性。
04
二甲双胍对老年SLI大鼠肠道菌群的有益作用
作者进一步研究了组间肠道微生物群的beta多样性（组间肠道微生物组成的变化）。有趣的是，SC-MET组的肠道微生物组成与其他三组不同；CLP-MET组的肠道微生物组成与SC组的相似性高于CLP组（图5C，D）。SC、SC-MET、CLP和CLP-MET组间的肠道菌群在门水平上存在差异。
图6. 二甲双胍对老年大鼠肠道菌群的有益作用
图7. 老年大鼠肠道微生物群与肝脏炎症的相关性分析。(A)肠道微生物群的相关分析表明，大肠杆菌志贺菌、克雷伯氏菌与双歧杆菌、Parabacteroides_distasonis呈负相关，歧杆菌科与Parabacteroides_distasonis、双歧杆菌呈正相关。(B)肠道微生物群与肝脏炎症的相关性分析显示，肝脏的TNF-α、IL-6、ccl2、cxcl1、ccl4与大肠杆菌_志贺氏菌、克雷伯氏菌呈正相关，与Muribaculaceae和Alloprevitella呈负相关。
功能预测结果表明二甲双胍可能会影响肠道的代谢途径。SC组中微生物的糖代谢、维生素代谢、氨基酸代谢和类聚异戊二烯代谢显著增强；CLP-MET组中的维生素代谢与CLP组相比显著增强。
研究结果表明二甲双胍通过有益地调节脓毒症引起的肠道微生物群失调来改善肠道漏性、炎症和肝损伤。老年SLI大鼠的克雷伯氏菌和志贺氏菌显著升高；二甲双胍治疗可逆转肠道菌群失调，增加双歧杆菌、Muribaculaceae、Parabacteroides_distasonis和Alloprevitella的丰度。提示二甲双胍可用于治疗脓毒症老年大鼠的肠漏、结肠炎症、肝损伤伴肠道菌群失调。
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