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助力组学研究系列第四期 | 荧光定量PCR检测

发布时间 2022-10-18

实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，qPCR）是指利用荧光信号的变化实时监测PCR（变性-退火-延伸）反应体系中每一个循环扩增产物的变化，通过Ct值或Ct值与标准曲线的关系，最终对起始模板进行精确的定量分析。该技术主要用于研究基因表达水平的检测。

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图1. SYBR Green I染料法

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图2. TaqMan探针法

根据荧光化学原理将qPCR分为SYBR Green I染料法和TaqMan探针法，前者相对简单、成本也略低一些。TaqMan探针法，需要设计合成探针引物，成本高，但特异性、准确度也提高。一般医疗检验使用TaqMan探针法（新冠病毒检测的金标准），用于科学研究两种方法均可，各有优势。

根据qPCR定量方法进行分类：绝对定量 / 相对定量。绝对定量需要作标准曲线，最终的结果表示每例样本中基因具体有多少拷贝数。而相对定量仅能表明A样本和B样本中基因表达水平相差了多少倍。病毒拷贝数、转基因拷贝数的检测使用绝对定量；基因表达差异比较选择相对定量。

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图3. 绝对定量

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图4. 相对定量

假如我们需要检测A基因在RNA水平的表达量，可参考下面的基本流程：

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qPCR检测应用

基因表达水平分析检测

高通量检测后差异表达基因的验证

引物设计

特异性引物是qPCR检测结果准确与否的关键。引物设计原则：

（1）GC含量在40%~60%之间；

（2）Tm值60℃左右，上下游引物Tm值相差最好不超过2℃；

（3）扩增产物长度在80-150bp之间最佳；

（4）避免出现二级结构和非特异性扩增；

（5）引物尽可能设计在基因的转录本共有外显子上。

通常一个引物设计好后还需要 Blast进行引物特异性验证（NCBI数据库Primer Blast）。

另外，给大家推荐几个引物设计软件；Primer3 plus、PrimerPremier、NCBI等，也可在PrimerBank、ICG、qPrimerDB - qPCR Primer Database搜索引物序列。

Total RNA的提取/反转录

一般使用TRizol法提取RNA，提取后的RNA在质控后进行反转录。RNA的质量主要从两个方面评估：纯度/完整性。纯度可在RNA提取后通过OD260/OD280比值得知，OD值在1.9-2.0之间，纯度高。RNA完整性通过琼脂糖凝胶电泳检测，电泳后明显看到28S、18S条带，且28S的条带亮度是18S的2倍左右，说明RNA完整性好。RNA样本为了避免反复冻融，建议大家尽快安排反转录。

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图5. RNA电泳结果

注意：在RNA的提取过程中要特别注意RNA酶的污染。在独立的空间进行提取，且全程使用无RNA酶的试剂耗材。可对使用的枪头、EP管进行灭菌、烘干处理，使用的相关试剂可以使用DEPC水配置。

引物预实验检测，qPCR条件优化

qPCR引物除了在设计时进行Blast特异性检测，后续还需要进行预实验验证。qPCR预实验结束后进行电泳，条带位置正确、且泳道中没有杂带，Ct值在正常范围内，且熔解曲线单峰，评估PCR实验体系的扩增效率。

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图6. qPCR引物电泳结果

qPCR上机检测

qPCR条件优化后可以准备正式实验了。由于 qPCR灵敏度高，所以每个样品/基因至少要做3个平行孔，以防在后面的数据分析中，由于Ct相差较多或者SD太大，无法进行统计分析。

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qPCR的扩增曲线是光滑的“S”型，分为基线期、扩增期（指数 / 线性）、平台期。熔解曲线单峰，熔解曲线分析可以用来确定不同的反应产物，包括非特异性产物，出现多峰显示PCR扩增出了多个产物。

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图7. 扩增曲线

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图8. 溶解曲线

此外，qPCR数据分析之前给大家再普及几个关键词：

基线：在qPCR扩增反应最初的数个循环中，荧光信号变化不大，近似一条直线，称之为基线。

荧光阈值：一般将qPCR反应前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光阈值是3-15个循环荧光信号标准差的10倍，荧光阈值设定在qPCR扩增的指数期。

Ct值：是指扩增产物的荧光信号进入指数扩增期时所需要的循环数，Ct值与起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。

熔解曲线：指随温度升高，双链扩增产物逐渐解链，导致荧光强度下降，到达某一温度，大量产物解链，荧光信号急剧下降，将此温度称之为Tm值，不同的PCR产物Tm值不同，从而可对qPCR的特异性进行鉴定。

qPCR数据分析

qPCR数据分析普遍采用操作简便的2^–ΔΔCT法。对所有检测样本，用内参基因的Ct值归一目标基因的Ct值。设置A2为1号样本目标基因的Ct值，A1为1号样本内参基因的Ct值，B2为2号样本目标基因的Ct值，B1为2号样本内参基因的Ct值，2号样本中目标基因的表达水平是1号样本目标基因的表达水平的2^–ΔΔCT倍。

ΔΔCT=（A2 - A1）-（B2 - B1）

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