发表期刊：Frontiers in Pharmacology
发表时间：2022.5
影响因子：5.988
合作单位：中南大学湘雅医院
百趣生物提供服务：TMT标记蛋白组
Profilin 1(PFN1)是一种肌动蛋白结合蛋白，在几种癌症的转移中发挥着不同的作用；然而，其在非小细胞肺癌(NSCLC)转移中的作用仍不清楚。作者应用TMT标记定量蛋白组技术研究其诱导肿瘤转移的机制。蛋白质组学分析显示PFN1参与微泡(MV)分泌。与非转移性NSCLC患者的血清相比，转移性NSCLC患者的血清中MV的丰度增加。体外和体内实验均表明，PFN1可以增加MV分泌，并且源自PFN1过表达细胞的MV显著促进NSCLC转移。同样发现PFN1可以与ROCK1相互作用并增强其激酶活性以促进肌球蛋白轻链(MLC)磷酸化从而促进MV分泌。ROCK1的抑制降低了MV的分泌并部分逆转了PFN1诱导的NSCLC转移的促进作用。总的来说，这些发现表明PFN1调节MV分泌以促进NSCLC转移。PFN1和MV代表了NSCLC转移的潜在预测因子或治疗靶点。
为了研究PFN1在NSCLC中的作用，作者采用IHC方法、组织芯片定量等实验，表明了PFN1参与了NSCLC的转移，并构建细胞系，通过RT-qPCR和Western检测过表达和敲除的影响，后又采用伤口愈合和Transwell迁移试验来确定PFN1对迁移的影响。
为了进一步研究EV和PFN1 OE细胞之间的分子差异以及影响NSCLC的可能信号通路。作者利用基于蛋白质组学的方法（TMT定量蛋白质组学）描述它们之间的蛋白质水平。差异蛋白质（DEPs）筛选条件为P值<0.05和倍数变化≤0.83或倍数变化≥1.2。结果确定了581个差异蛋白质，其中327个上调的蛋白质和254个下调的蛋白质（图2）。
图2. 差异表达蛋白分析热图
接下来，利用富集分析来确定这些DEPs是否可以指向任何特定的生物学功能，从而可以深入了解它们在生物学功能上的差异。GO注释表明DEPs涉及蛋白质结合、细胞成分组织或生物发生和细胞器组织（图3）。大多数不同表达的蛋白与细胞器相关，这与PFN1在细胞膜运输中的作用相一致。同源蛋白群簇(COG/KOG)分析显示，DEPs参与了翻译后修饰、蛋白质转换、伴侣蛋白、细胞内运输、分泌、囊泡转运和信号转导机制（图4）。通过蛋白质组学分析，我们推断PFN1可能通过蛋白相互作用和信号转导参与细胞外囊泡分泌，进而促进NSCLC转移。
图3. 差异表达蛋白的GO富集分析
图4. 差异表达蛋白的COG／KOG分析
由于PFN1在细胞膜运输中起着重要作用，而MVs是癌症转移的关键介质，我们从临床样本的血清中提取了细胞外囊泡(MVs和外泌体)。通过一系列实验，发现PFN1可能调控MLC的磷酸化，而磷酸化可以调节MV的分泌。
Mv是癌症转移的关键介质。作者收集了转移性（n=25）和非转移性（n=20）肺癌患者的血清样本，并提取了Mv（图5）。作者通过一系列过表达，以及伤口愈合和Transwell迁移实验，发现PFN1可能通过诱导MV分泌促进NSCLC转移。
图5. 为确定PFN1在肿瘤转移中的作用而建立的转移瘤小鼠模型示意图
为了进一步研究PFN1在NSCLC转移中的作用，我们通过心内注射H1299NSCLC细胞建立了肿瘤转移的小鼠模型，结果进一步证实了PFN1在NSCLC转移中的作用（图6）。
图6. HE染色小鼠模型肺组织的代表性图像/肺组织中PFN1和p-MLC表达的代表性IHC图像
作者通过敲低、过表达、co-IP、Western blot、免疫荧光、流式细胞术等实验，发现PFN1可以与ROCK1相互作用，增强其激酶活性，并间接促进MLC磷酸化，最终诱导MV分泌。ROCK1抑制剂Y27632部分逆转了PFN1促进MLC磷酸化和MV分泌的作用（图7）。
图7. western印迹法测定PFN1过度表达(A)/敲除(B)后的蛋白表达/PFN1突变体中的蛋白表达(c)
创面愈合实验显示（图8），Y27632处理的过表达PFN1的细胞迁移减少到接近EV细胞.接下来，将过表达PFN1的细胞来源的MVs添加到y27632处理的细胞中，发现Y27632并没有逆转过表达PFN1的细胞来源的MVs诱导的迁移，从Transwell迁移实验中也得到了类似的结果，此外也用小鼠模型验证了这些结果。
图8. 伤口愈合实验评估Y27632的疗效
研究结果表明，PFN1是关键的肌动蛋白调节蛋白，调控肌动蛋白细胞骨架的关键蛋白之一，它通过ROCK/p-MLC通路促进MV的释放，从而促进NSCLC的转移。因此，PFN1可能是NSCLC转移的潜在治疗靶点。通过减少MVs的释放，有可能会部分逆转PFN1过表达诱导的NSCLC细胞迁移。本研究为靶向转移治疗NSCLC提供了一种潜在的新方法，值得进一步研究。
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