发表期刊：Proteomics
发表时间：2019年9月
影响因子：4.044
洋葱蓟马（烟粉虱）(thrips tabaci Lind.)属翅目蓟马，是一种多食性农业害虫，由于大量使用化学杀虫剂，杀虫剂抗药性经常被报道。赖氨酸乙酰化是一种普遍存在的翻译后修饰，在基因调控中起着重要作用。深入了解转录调控对于设计新型的、高效的农药至关重要。目前，在烟粉虱中赖氨酸乙酰化的靶点是完全未知的。团队采用免疫纯化、高效液相色谱分离和高分辨率串联质谱技术富集乙酰化肽段，在蛋白质组水平上系统鉴定烟粉虱赖氨酸乙酰化位点。此外，作者还都对乙酰化蛋白进行了功能分类，并预测了其亚细胞定位。功能富集分析结果表明，乙酰化作用涉及多种功能蛋白。这些研究结果为洋葱蓟马的乙酰化功能研究提供了有价值的资源，并有助于阐明其转录调控和设计新的控制策略。
为了系统地确定烟粉虱蛋白赖氨酸乙酰化位点，采用了胰蛋白酶消化、HPLC分离、抗乙酰赖氨酸抗体亲和富集和高分辨率orbitrap LC-MS/MS分析的综合方法。在已鉴定的蛋白中，有579个蛋白包含995个赖氨酸乙酰化位点(表1)。赖氨酸乙酰化事件发生在超过一半的鉴定肽上，而其余大部分肽未被修饰。
为了评估乙酰化位点在烟粉虱蛋白质组中的分布，作者计算了每个蛋白质的乙酰化修饰位点的数量。三分之二的蛋白只有一个乙酰化位点，其次是19%的蛋白有两个乙酰化位点，而其余的蛋白至少包含三个修饰位点(图A)。
此外，作者还研究了蛋白质二级结构中赖氨酸乙酰化位点的分布。利用最新的预测软件NetSurfP-2.0对烟粉虱全组蛋白进行二级结构预测。在以往的研究中发现，乙酰化的赖氨酸残基更倾向于位于蛋白质的结构区域。因此，作者比较了所有赖氨酸和乙酰化赖氨酸的二级结构，重点关注了结构赖氨酸和非结构赖氨酸的百分比的变化(图B)。
GO注释显示，与代谢过程(36.72%)相关的乙酰化蛋白最多，其次是细胞过程(29.17%)和单有机体过程(23.83%)，而与定位(4.04%)和生物调节(3.12%)相关的乙酰化蛋白所占比例较小(图C)。分子功能方面，前两大基团中与结合(42.86%)和催化活性(42.24%)相关的GO项，其余主要与结构分子活性(7.9%)和转运蛋白活性(3.4%)相关(图D)。
作者对所有已鉴定的乙酰化蛋白进行了KEGG通路富集分析。结果表明，大部分修饰蛋白与代谢途径、碳代谢、氨基酸生物合成、脂肪酸代谢和2-羟基羧酸代谢相关(图A)。
为了探索乙酰化蛋白中大量出现的结构域，作者还进行了蛋白质结构域富集分析。结果表明，NAD(P)结合结构域富集程度最高结构域(P = 2.39e-12)，其次是聚酮合酶结构域、烯酰还原酶结构域(P = 5.35e-07)。聚酮合酶是一类参与多种次生代谢物生产的酶，由脱水合酶、酮还原酶和烯基还原酶结构域的多种组合组成。此外，一系列富集结构域与各种生理过程中涉及的酶有关，包括酰基辅酶a氧化酶/脱氢酶的n端、c端、中间和中心结构域，谷胱甘肽s -转移酶的n端和c端结构域，核糖体蛋白S5结构域2型折叠，醇脱氢酶的c端结构域，6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶结构域2，醛脱氢酶的c端和n端结构域(图B)。
在作者的研究中，功能富集结果也表明，中心代谢通路受到赖氨酸乙酰化的显著影响。
目前，蛋白质组全赖氨酸乙酰化鉴定已在几种昆虫中报道。为了评价乙酰化蛋白在昆虫中的保守性，作者对它们之间的乙酰化蛋白进行了比较分析。本文从文献中收集了两种代表性昆虫家蚕B. mori和果蝇D. melanogaster的乙酰体数据。利用eggNOG数据库为3种昆虫的乙酰化蛋白数据集分配euNOG条目。其中，来自烟粉虱、家蚕和果蝇的569、323和933个乙酰化蛋白被euNOG标记。作者使用维恩图来说明三种昆虫中独特且通常分配给乙酰化蛋白的euNOGs(图A)。结果发现，每个生物的euNOG条目总和都少于具有euNOG赋值的乙酰化蛋白，这是由于不同蛋白存在冗余的euNOG条目。令人惊讶的是，3种昆虫共有90个euNOG条目，分别对应于烟粉虱(T.tabaci)、家蚕(B.mori)和果蝇(D.melanogaster)的137个、106个和116个乙酰化蛋白。
此外，使用DAVID v6.8对研究充分的果蝇生物中的保守蛋白进行了基因本体(GO)富集分析。结果表明，乙酰化蛋白具有较好的活性与几个生物过程显著相关(图B)。
为了了解烟粉虱乙酰化赖氨酸的性质，利用Motif-X程序对所有已鉴定乙酰化位点的序列基序进行了分析。在本研究中确定的乙酰化赖氨酸位点周围的6到+6位置，氨基酸分布存在明显的偏倚(图A)。此外，作者生成了序列标识，以确定乙酰化赖氨酸周围的序列基序是否针对不同的细胞间隔(图B)。此外，作者分别分析了两组特别感兴趣的核蛋白，组蛋白和转录因子的序列基序(图C)。组蛋白的基序与核蛋白的基序有本质上的不同，但它与先前报道的组蛋白基序一致(赖氨酸均位于4位)。
为了确定果蝇乙酰体内的蛋白互作关系，我们将果蝇中烟粉虱乙酰化蛋白的同源序列映射到STRING蛋白互作数据库上。结果发现，一个由17个核糖体蛋白组成的模块与核糖体活性显著相关，表明乙酰化对蛋白质合成具有调控作用(图A)。类似地，8种参与脂肪酸代谢的酶形成了一个亚网络(图B)。重要的是，能源生产效率高氧化磷酸化过程形成了一个紧密连接的簇(图C)，此外，一个较小的、节点连接松散的子网络被发现与嘌呤代谢相关，表明乙酰化对核苷酸代谢过程的调节(图D)。综上所述，乙酰化可能参与了烟粉虱细胞翻译机制、物质代谢和ATP产生的调节。
本研究首次对烟粉虱进行了全面的乙酰体分析。利用高分辨率质谱蛋白质组学方法鉴定了579个含有995个乙酰化位点的乙酰化蛋白。功能分类表明，这些乙酰化蛋白参与多种生物过程或细胞过程。此外，根据途径富集分析，糖代谢、脂代谢、氨基酸代谢和翻译机制与乙酰化蛋白显著相关。对乙酰化蛋白的比较分析表明，三种昆虫中有相当比例的乙酰化蛋白是保守的。基序分析表明，乙酰化倾向于发生在蛋白质富含赖氨酸的区域，不同亚细胞间的位置特异性氨基酸偏好不同。综上所述，本研究为研究烟草粉虱赖氨酸乙酰化位点提供了有价值的资源，有助于研究乙酰化位点在烟草粉虱中的功能作用。
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