发表期刊：Cell Metabolism
影响因子：31.373
作者单位：复旦大学附属肿瘤医院
发表时间：2022年10月
百趣生物提供服务：非靶代谢组+脂质组检测分析
三阴性乳腺癌(Triple-negative breast cancer ,TNBC)是临床上一种异质性疾病，约占确诊乳腺癌的15%。因异质性高、预后差、复发转移风险高等特点，成为乳腺癌研究中亟需攻克的顽固“堡垒”。2019年邵志敏/江一舟团队根据分子特征、代谢重编程和肿瘤微环境方面的异质性提出三阴乳腺癌的“复旦分型”，随后又针对不同亚型进行了系列精准治疗临床试验。与传统化疗相比，新的疗法治疗效果水平呈上升趋势，但是低于预期。
铁死亡（Ferroptosis）是一种非凋亡性和铁依赖性细胞死亡方式，近年来在肿瘤研究领域表现活跃。在Fe2+或酯氧合酶的作用下，含多不饱和脂肪酸链的磷脂(PE-PUFAs)发生脂质过氧化，诱导细胞铁死亡，这一过程受多种代谢途径的调控，然而TNBC铁死亡的特性仍未揭示。因此TNBC“复旦分型”仍需进一步的研究，探寻新的治疗靶点，以发现TNBC新的治疗突破口。
技术路线
研究结果
1.TNBC“复旦分型”各亚型铁死亡具有异质性
本研究通过对TNBC转录组、非靶代谢组及脂质组数据集分析和验证实验证实“复旦分型”中各亚型铁死亡存在异质性。间质样亚型（Mesenchymal-like, MES）呈现HAMP（铁稳态调节因子，图1C）低表达和铁代谢的失调(图1E)；腔面雄激素受体亚型（luminal androgen receptor, LAR）与铁死亡相关的代谢途径被激活（图1A），铁死亡相关基因、蛋白及代谢物出现高度活跃(图1B-F)；与LAR亚型相比，免疫调节亚型（immunomodulatory, IM)和基底样免疫抑制亚型(basal-like and immune-suppressed, BLIS)铁死亡相关通路变化水平较低，未出现显著铁死亡相关特性（图1A）。这一结果表明LAR亚型是TNBC中铁死亡敏感性最高的亚型。
图1. TNBC各亚型中铁死亡相关特征的异质性
2.谷胱甘肽（GSH）代谢中的GPX4是调控LAR亚型肿瘤铁死亡的关键靶点
代谢组通路富集分析显示，LAR亚型肿瘤GSH代谢显著上调，GPX4在LAR亚型肿瘤中表达量高且对铁死亡高度敏感（图1F、图2）。基于以上发现进行细胞和类器官的药敏实验，进一步探索了针对LAR亚型肿瘤铁死亡的最佳治疗策略，结果表明GPX4抑制剂RSL3对LAR亚型抑制效果更加明显（图3）。
图2. GSH代谢是抑制LAR亚型肿瘤铁死亡的关键
图3. 不同敏感性的铁死亡诱导剂突显了GPX4在LAR亚型肿瘤中的重要性
3. 雄激素受体（AR）与GPX4启动子结合，双向调控LAR亚型肿瘤铁死亡
为了探索LAR亚型肿瘤中GPX4表达增加的机制，作者首先对多组学数据进行分析，结果显示AR信号通路密切相关的FA代谢、雄激素反应等通路与GPX4的表达呈现正相关（图4A）。免疫印迹和qPCR的结果表明，AR对LAR亚型肿瘤中的GPX4起到调控作用（图4B）。进一步的荧光素酶报告基因及ChIP-qPCR发现AR与GPX4-2500～-2000bp启动子区的AR结合位点（AR binding sites, ABSs）结合并驱动GPX4的表达，从而调控LAR亚型中的GPX4高表达（图4C）。
图4. AR是LAR亚型肿瘤中GPX4表达的关键调控因子
基于AR对GPX4的调控作用，作者对AR抑制剂是否与GPX4抑制剂一样，可以作为促进LAR亚型肿瘤铁死亡的潜在抑制因子这一问题进行探究。通过免疫印迹、脂质过氧化检测和BODIPY581/591C11染色对AR抑制剂和GPX4抑制剂诱导的LAR亚型肿瘤细胞系铁死亡进行对比，AR抑制剂并未明显提高肿瘤细胞内脂质过氧化水平（图5A-C），究其原因是AR在细胞中的调控作用是双向的，AR既可以促进铁死亡相关多不饱和脂肪酸的生物合成，又可以上调GPX4的表达，减少引起铁死亡的脂质过氧化（图5D-E）。相较于抑制AR，GPX4抑制剂诱导LAR肿瘤铁死亡的效果更佳。
图5. AR具有双重作用来调节铁死亡
4.GPX4抑制剂抑制肿瘤生长、对肿瘤微环境进行重编
基于以上的体外研究，确定了LAR亚型的铁死亡敏感性和GPX4抑制剂具有诱导铁死亡作用。作者通过建立LAR亚型乳腺癌小鼠模型进行体内实验（图6A-B），发现无论是沉默Gpx4基因还是使用GPX4抑制剂都可以显著诱导肿瘤细胞的铁死亡，抑制肿瘤生长，增加CD8+、CD4+等不同亚群T细胞数量，触发肿瘤微环境获得炎症表型，使LAR亚型肿瘤微环境由“冷”转“热”（图6 C-F）。
图6. GPX4抑制剂在体内抑制肿瘤生长并重新编程肿瘤微环境
5. GPX4抑制剂联合ICB疗法为LAR亚型肿瘤治疗带来新方向
为了测试GPX4抑制剂和免疫检查点阻断（immune checkpoint blockade，ICB）治疗是否起到协同作用，通过TS/A小鼠乳腺癌细胞系来建立TS/A异种移植瘤进行体内实验（图7A），结果显示与单一治疗相比，GPX4抑制剂和PD-1抗体联合治疗显著抑制肿瘤生长，虽然未引起免疫细胞浸润，但PRF1+CD8+T细胞和GZMB+CD8+T细胞的比例显著增加，出现明显免疫反应（图7）。以上结果表明GPX4抑制剂与ICB联合疗法治疗LAR亚型肿瘤是一种理想的治疗策略，临床免疫治疗及小鼠细胞系免疫治疗队列研究也证实这一结果。
图7. GPX4抑制剂与ICB联用疗法对LAR亚型肿瘤有显著治疗效果
结论
本研究通过多组学数据集分析和体内外实验验证系统地揭示了TNBC“复旦分型”各亚型具有铁死亡异质性，其中LAR亚型肿瘤细胞ROS积累，FA代谢富集，脂氧合酶过度表达，并操纵GSH代谢防止铁死亡的发生。且LAR亚型肿瘤对铁死亡抑制剂、尤其是GPX4抑制剂敏感，是铁死亡治疗最为敏感的亚型。基于这些特征，靶向铁死亡抑制剂与免疫检查点阻断相结合的疗法，为LAR亚型肿瘤提供了精准治疗新方向，为三阴性乳腺癌患者带来新希望。
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