发表期刊：Carbohydrate Polymers
影响因子：10.723
作者单位：遵义医科大学
百趣提供服务：16S测序
研究背景
流行病学研究表明，全世界约有5亿过敏性鼻炎(Allergic rhinitis, AR)患者，每年呈增长趋势。AR虽不会危及生命，但是其临床症状引起的情绪问题和间接经济损害不容忽视。在AR病理学研究中，发现Th1/Th2失衡以及异常高的免疫球蛋白E(immunoglobulin E, IgE)和肥大细胞表达水平是AR的重要致病因素。NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3, NLRP3)炎性小体作为先天免疫的重要组成部分，在机体的免疫反应和疾病发生中起着至关重要的作用。其和IL-1β的过表达都存在于AR中，IL-1β促进Th0向Th17细胞分化，释放IL-17和其他相关细胞因子，从而促进过敏反应。而肠道微生物群的不平衡可诱发过敏反应，增加IgE的产生，也最终导致AR。
目前治疗AR的临床药物只能缓解症状，长期使用可能会引起嗜睡等副作用。因此，重要的是开发更好的AR治疗方法，减少不良反应。益生元可以调节肠道菌群失衡，修复肠道机械屏障，改善AR。而多糖除了是益生元外，还具有广泛的药理活性，例如抗炎、免疫调节等。
本研究以一种新的水提金银花多糖(Water-extracted Lonicera japonica polysaccharide, WLJP)为研究对象，按每组8只小鼠，分为对照组（给予生理盐水）、AR组（给予卵清蛋白(ovalbumin, OVA)）、WLJP-L组（30mg/kg WLJP-0.25p）和WLJP-H组（60mg/kg WLJP-0.25p）。除对照组外，其余三组分别在0、3、6、9、12、15天进行致敏处理；在21-30天，对WLJP-L组和WLJP-H组进行灌胃给药，对照组及AR组给予生理盐水。于第31天将小鼠置于观察笼中，观察并记录小鼠在10分钟内的喷嚏和摩擦次数（图1A）。随后，麻醉小鼠，收集鼻粘膜、结肠组织和眼静脉丛，以获得血液和组织样本。进一步进行细胞因子检测、鼻腔组织的病理学评价、免疫荧光检测、流式细胞术分析、蛋白质印迹法(western blot, WB)分析、16S rDNA测序、分子对接和动力学模拟，以研究其对AR的免疫调节作用及其作用机制。
研究结果
1.WLJP-025p的提取、分离及化学性质分析
按照蒸馏水提取、乙醇沉淀冻干的流程来制备WLJP（5.1%），高效凝胶渗透色谱分析表明WLJP-025p是一个均匀的多糖组分。然后采用柱前衍生化高效液相色谱测定其糖成分，显示其为一种具有中性糖侧链的富含HG结构域的果胶多糖。最后通过核磁共振实验得出其主要结构性质。
2.WLJP改善OVA诱发的过敏性鼻炎
在摩擦和打喷嚏评估（图1B）中，在AR组有显著增加，而WLJP-L和WLJP-H组显著改善。AR组的血清IgE水平明显高于对照组，WLJP治疗显著降低了IgE浓度（图1C）。在图1D中，苏木精—伊红染色法(hematoxylin and eosin, H&E)染色显示AR组的表皮明显增厚，WLJP治疗显著抑制表皮厚度。在过碘酸-雪夫染色(periodic acid Schiff, PAS)中（图1E），对照组的鼻粘膜中未发现杯状细胞，而AR组观察到大量杯状细胞，WLJP-H组杯状细胞表达减少。
图1. WLJP改善OVA诱发的过敏性鼻炎
3.WLJP抑制小鼠鼻粘膜NLRP3炎性小体的激活和OVA诱发的Th17细胞的分化
WLJP抑制NLRP3、CASP1表达和NLRP3炎症小体激活（图2A）。WLJP显著抑制了OVA诱导的鼻粘膜组织中NLRP3炎症体元件（NLRP3、CASP1、IL-1β）蛋白表达的上调（图2B）。AR组中IL-17红色和p65绿色染色丰富，且p65主要在细胞核中表达，然而WLJP-L和WLJP-H组的IL-17和p65表达水平显著降低，只有少量p65在细胞核中表达（图2C）。同时，WLJP在鼻粘膜组织WB检测中以剂量依赖性方式抑制核p65易位和IL-17表达（图2D）。在流式细胞术分析中，观察到AR组的Th17细胞表达显著高于对照组，而WJLP-L和WLJP-H组的Th17-细胞表达均降低（图2E）。AR组血清IL-17（图2F）和IL-β（图2G）浓度增加，而WLJP-L和WLJP-H不同程度的抑制IL-17的释放。
图2. WLJP抑制OVA诱导的相关炎症通路作用和Th17细胞分化
4.WLJP抑制小鼠肠道NLRP3炎症小体激活并减轻肠道屏障损伤
WLJP抑制结肠组织中AR诱导的NLRP3炎症小体活化（图3A）和NLRP3过度表达（图3B）。H&E染色显示小鼠结肠的病理变化如图3C。结果显示，WLJP抑制AR诱导的粘附连接蛋白β-连环蛋白和E-钙粘蛋白、紧密连接蛋白ZO1和闭塞蛋白表达的减少，肠粘膜上皮组织分布减少（图3D，E）。
图3. WLJP减轻小鼠肠道屏障损伤并抑制肠道NLRP3炎症小体激活
5.WLJP可减轻OVA诱导的小鼠肠道微生物群的异常变化
进一步的肠道微生物分析显示，每组中同时出现了472个属（图4A），OVA和WLJP给药改变了微生物属的组成（图4B）。图4C是对前50个属水平细菌的相关性分析，其中有9个菌发生了显著变化。WLJP显著抑制AR诱导的小鼠肠道微生物群异常变化（图4D）。根据显著改变的属的丰度情况（图4E）和功能预测的结果（图4F），发现与炎症和免疫功能相关的基因比例发生了变化，表明肠道微生物与AR的发病机制以及WLPJ的改善有关。
图4. WLJP可减轻OVA诱导的小鼠肠道微生物群的异常变化
6.分子对接和动力学模拟
通过模拟WLJP-025p的水解片段和NLRP3的可能作用模式（图5A），发现可能的结合位点如图5B所示。对停靠构象进行了50ns分子动力学模拟。首先分析了蛋白质-小分子配合物在分子动力学轨迹上的均方根偏差(Root Mean Square Deviation, RMSD)，如图所示，持续10ns后，4个RMSD处于稳态，对10-50ns的轨迹进行采样和分析。其中5个GalA单体稳定结合在蛋白腔内，另外5个稳定结合在蛋白表面的凹槽内(图5C)。同时发现结合小分子的蛋白质结构整体是稳定的。大多数氨基酸的均方根波动(Root Mean Square Fluctuation, RMSF)在0.2nm以下，其中>0.2氨基酸位于C端和N端，即环区(图5D)。最后，发现小分子和蛋白质形成的氢键数约为10个(图5E)。
图5. 分子对接和动力学模拟
WLJP靶向NLRP3抑制巨噬细胞炎症
(12-)豆蔻酸佛波酯(-13-)乙酸盐(phorbol 12-myristate 13-acetate, PMA)，诱导THP-1细胞成为巨噬细胞，联合NLRP3抑制剂研究WLJP的作用机制。图6A所示，WLJP和NLRP3抑制剂CY-09均不影响巨噬细胞的存活能力。在ELISA TNF-α（图6B）和IL-1β检测（图6C）中，发现WLJP和CY09均能抑制LPS+IFN-γ引起的炎症反应。随后对CY-09和WLJP组进行的交互分析，表明这两个因素对LPS+IFN-γ组的因变量TNF-α和IL-1β有显著的交互作用。巨噬细胞免疫荧光染色显示，WLJP和CY-09抑制NLRP3炎症小体活化（图6D）。在巨噬细胞WB分析中，观察到WLJP显著抑制NLRP3炎症小体活化和炎症表达，与鼻粘膜WB分析结果一致（图6E）。在NLRP3抑制剂CY-09中也观察到了同样的现象。同样，CY-09和WLJP组的相互作用分析显示了显著的相互作用。
图6. WLJP靶向NLRP3抑制巨噬细胞炎症
结论
金银花的一种新型金银花多糖“WLJP”可能通过修复受损的肠道屏障、调控炎症免疫交互对话来改善AR。
文献下载链接：
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