文章标题：Astragaloside IV derivative HHQ16 ameliorates infarction-induced hypertrophy and heart failure through degradation of lncRNA4012/9456
发表时间：2023年10月
发表期刊：Signal Transduction and Targeted Therapy
影响因子：39.3
国自然关键词：黄芪、心肌梗、心功能
近期，海军军医大学的张卫东、刘霞教授及西南医科大学段大跃教授团队在Signal Transduction and Targeted Therapy(IF=39.3)上合作发表题为"Astragaloside IV derivative HHQ16 ameliorates infarction-induced hypertrophy and heart failure through degradation of lncRNA4012/9456"的研究论文。该研究发现新型小分子黄芪甲苷(Astragaloside IV)衍生物HHQ16通过与长链非编码RNA(long non-coding RNA, lncRNA)-lnc4012/9456特异性结合导致其降解，进而拮抗G3BP2/NF-κB信号通路信号传导，使心肌细胞产生抗肥厚作用，进而有效逆转心肌梗死后(post-myocardial infarction, MI)的心室重构并改善心功能。接下来具体看看本文作者是如何推进实验的？
1、HHQ16可显著改善梗死性心衰小鼠心功能，逆转心肌重构
本研究通过左冠状动脉前降支结扎(coronary artery ligation, LADL)诱导缺血引起的心衰(heart failure, HF)实验确定HHQ16处理可以有效地逆转LADL诱导的小鼠心功能恶化和结构重构。具体结果如图1所示，在治疗后小鼠左心室射血分数(left ventricular ejection fraction, LVEF)、左心室缩短分数(left ventricular fractional shortening, LVFS)、心脏体积增大和心脏重量(heart weight, HW)/体表面积比(body surface area, BSA)等指标显著改善。
图1. HHQ16显著改善心功能，逆转心衰小鼠心肌重构
2、HHQ16直接作用于心肌细胞产生抗肥厚作用
如图2所示，作者通过检测心肌肥厚标志物β-Mhc、Anp和Bnp等指标揭示HHQ16对心肌肥厚具有显著的调控作用，并且通过减少细胞体积（大小）显著减少LADL诱导的肥大也证实这一点。此外，作者进行体外肥大模型验证，也进一步证实HHQ16直接作用于体外心肌细胞，抑制心肌细胞体积扩张、逆转ANP和BNP蛋白表达增加。综上，HHQ16可以使肥厚的心肌细胞恢复到更正常的大小。
图2. HHQ16通过直接作用于心肌细胞抑制心肌肥厚
3、HHQ16的作用与Egr2基因相关转录本lnc9456的强抑制
为了进一步揭示HHQ16在肥厚标志物（β-Mhc、Anp和Bnp）转录调控中的作用机制，本研究进一步分析了lncRNA测序数据。HHQ16下调23个在HF组小鼠中表达上调的lncRNA。通过qRT-PCR验证，最终筛选出ENSMUST00000219456(lnc9456)为HHQ16影响最大的lncRNA。在肥大的心脏中lnc9456显著增加近17倍。此外，HHQ16还显著抑制心肌细胞中lnc9456的高表达，这表明HHQ16对心肌肥厚和HF的抑制作用，可能是通过介导新的Egr2基因相关转录本-lnc9456实现的（图3）。
图3. HHQ16强抑制lnc9456
4、Lnc9456对心肌细胞肥大至关重要
Lnc9456在正常的心脏中几乎检测不到，但在LADL术后的肥大和衰竭的小鼠心脏以及异丙肾上腺素(isoproterenol, ISO)体外处理的肥大心肌细胞中高度表达。以上的处理条件增加lnc9456和肥大生物标志物的表达水平，表明lnc9456可能是诱导心肌细胞肥大的致病因素。作者使用重组腺病毒(Adenovirus, AdV)进行体外实验，结果表明lnc9456在神经激素激活驱动的心肌细胞肥大中起关键作用（图4）。
图4. Lnc9456对心肌细胞肥大至关重要
5、Lnc9456与G3BP2相互作用并促进NF-κB信号通路
作者通过蛋白互作预测筛选可能与lnc9456相互作用的潜在蛋白，其中被鉴定为G3BP2的蛋白与lnc9456直接相互作用的概率最高。本文进行体外试验发现G3BP2也包含在鉴定出的具有RNA结合功能的2113个蛋白中。接下来，作者首先检测了LADL是否对G3BP2的表达有任何影响。结果发现小鼠中LADL引起G3BP2表达的呈时间依赖性增加，并通过干扰lnc9456表达揭示了lnc9456和G3BP2之间存在内在联系。蛋白质印迹分析表明G3BP2与lnc9456的结合可能需要高水平的lnc9456。既往研究报道G3BP2可能与IκBα结合，进而促进NF-κB亚基p65在核内聚集，启动肥厚基因转录，诱导心肌肥厚。作者通过免疫共沉淀实验和免疫荧光实验证实了lnc9456的过表达能够增强G3BP2与IκBα的结合，并促进NF-κB亚基p65的核内聚集（图5）。
图5. Lnc9456与G3BP2相互作用，促进NF-κ p65亚基的核易位
6、HHQ16直接与lnc9456高亲和力结合并诱导其降解
Lnc9456是促肥厚因子，而HHQ16可显著降低肥厚心脏及心肌细胞中lnc9456的水平，揭示HHQ16可能通过靶向lnc9456实现心肌肥厚及HF的作用。结果HHQ16显著减少了lnc9456的半衰期，并仍有能力降低AdV-lnc9456诱导的心肌细胞中lnc9456的高表达，更一步揭示这种调控可能发生在转录后水平。作者发现在体外转录系统中HHQ16以时间和剂量依赖性方式降低了lnc9456水平。此外，HHQ16降解lnc9456只发生在心肌细胞裂解物存在的情况下。根据微热泳(microscale thermophoresis, MST)的数据推测HHQ16可与lnc9456特异性结合并促进其在心肌细胞中的降解（图6）。
图6. HHQ16直接与lnc9456高亲和力结合，诱导其降解
7、Lnc9456是HHQ16逆转小鼠心肌肥厚和功能障碍所必需的
本文进一步评估了增加lnc9456对心脏的影响以及HHQ16在体内的作用。作者通过诱导心肌细胞特异性lnc9456的过表达实验发现HHQ16处理可降低心脏中高水平的lnc9456，进一步支持HHQ16通过转录后抑制lnc9456发挥作用。同时，作者通过对小鼠进行灌胃实验，通过监测LVEF和LVFS、HW/BSA、ANP, BNP和β-MHC的表达水平等指标，确定了lnc9456是HHQ16逆转心肌肥厚和心衰的特异性靶点（图7）。
图7. Lnc9456是HHQ16逆转小鼠心脏肥厚和功能障碍所必需的
8、人类同源物lnc4012是HHQ16的真正靶点
lnc9456的同源基因LOC107984012(lnc4012)是HHQ16的真正靶点。为佐证这一点，作者通过测定lnc4012表达水平发现其上调与心肌肥厚和HF密切相关。为进一步明确lnc4012在心脏中的功能，作者通过体外实验发现ISO不仅提升肥大生物标志物ANP, BNP和β-MHC的表达，而且以剂量依赖性的方式增加了lnc4012的表达水平，表明了lnc4012的上调确实与肥大基因转录的增加和心肌肥厚的发生发展密切相关。
与lnc9456相同，其能够在lnc4012过表达心肌细胞的洗脱液中捕获更多内源性G3BP2蛋白。研究lnc4012与G3BP2的结合模式发现了一个351-378 bp的转录片段是结合所必需的，而该片段两个截短突变体（Δ251-478 bp和Δ351-378 bp）可阻断lnc4012与G3BP2结合。此外，IκBα仅在4012过表达的洗脱液中被检测到。过表达lnc4012也促进了NF-κB p65从细胞质向细胞核的转位。以上结果从侧面佐证了lnc9456和lnc4012分子机制的一致性。
此外，研究发现相较于lnc9456，HHQ16对lnc4012的亲和力更高，并以时间依赖性方式促进体外转录的lnc4012的降解。HHQ16能显著降低ISO诱导的lnc4012表达。以上结果支持lnc4012是HHQ16逆转病理性肥大和HF的有效靶点这一观点。
图8. 人类同源物lnc4012是HHQ16的真正靶点
本研究以中药黄芪的有效化合物黄芪甲苷为引，研究了其小分子衍生物HHQ16在心肌梗塞引起的心肌重构中的关键作用。揭示了小分子HHQ16通过与lnc4012/lnc9456特异性结合，导致其降解，并拮抗其对G3BP2/NF-κB信号通路的作用，有效逆转梗塞引起的肥大和心力衰竭。
