研究团队首先用已知数据集（ZymoBIOMICS™ Microbial Community）对ONT和Illumina的混合组装方法与其他几种组装方式进行比较，发现混合组装方式从完整度、污染率、细菌基因组平均遗传相似度（average nucleotide identity, ANI）和编码密度方面都有更好的效果。同时通过对两个人群的肠道数据分析发现，混合组装方式能提高数据质量。与二代宏基因组组装结果比较发现，混合组装方式虽然少了17.3%的contigs，但组装序列数量多了5.1%，N50值提高了3倍多。对contigs进行分箱后得到能代表单个菌种的重建宏基因组装基因组 (metagenome-assembled genomes，MAGs)，通过混合组装方式得到平均N50为117kb的9,612个MAGs（每个样本20~83个），去重后得到692个MAGs（图1b，1c），其中有623在UHGG数据库中，且有208个MAGs的质量更高，同时也发现了67个新的genomic bins，用新版本dRep去重后减少了2个MAGs。从全面性考虑，159个非冗余的MAGs均包含了23S、16S和5S rRNA序列，448个MAGs至少含有其中一种类型的rRNA。基于Illumina的组装方式得到616个MAGs，N50约为混合组装的一半，且只有9个MAGs含有三种类型的rRNA序列，258个MAGs含有至少一种rRNA序列。所有样本中，Fusicatenibacter saccharivorans出现的频率最高，其次是Anaerostipes hadrus和gathobacter rectalis，有189个菌以MAGs的形式出现在至少10个样本中。

鉴于ONT测序能发现更多SVs的特点，通过MAGs的比对，发现多种类型的SVs。189个菌通过dRep比对，鉴定出了317558个插入突变，34129个缺失突变和1373个基因倒位（图1d）；接下来又随机选取插入突变和缺失突变两个峰中（140~160bp和1050~1150bp，图1e）SVs片段进行分析，发现移动元件和染色体外移动基因元件(extrachromosomal mobile genetic elements，eMGEs)在两种突变的短SVs片段中更多，从而推断短序列的SVs可能与噬菌体整合和其他移动元件相关；但并不是所有SVs都有可检测的移动元件，其他的SVs可能是复制和重组引起，具体机制有待进一步验证。

接下来，通过重新匹配参考MAG或者MAG中含有SV的序列，以进一步验证检测出的SVs。人工匹配后发现97%以上随机挑选SVs集与ONT多处位置的Reads数目一致，从而验证了单分子测序得到特异SVs的可靠性（图2a），同时也发现同一个体相同细菌基因SVs的低异质性。

对种水平（MAGs）的SVs分析发现，SVs总数与所有样本中的MAGs数和基因大小正相关。但由于细菌基因组中SVs在人群中分布的不均匀性，所以进一步校正平均SV数和基因组大小，发现1M基因组中门水平多样性最高的Firmicutes有20.4的SVs,Akkermensia所属的Verrucomicrobia有19.5的SVs,而Desulfobacteroita和Proteobacteria的SVs最少（图2b,2c）。

对两个人群的189个MAGs分析发现，不同个体间每Mb基因组中有16.7的SVs，而同一个体不同时间点每Mb基因组种SVs的中位值为0。因此，SVs可用于区分个体间的细菌种类和肠道菌群，同时对于特定菌10天内在个体内的稳定性（图2d）结果间接表明LifeLines cohort队列发现的3年内菌株分化或置换可能是由于SV的逐步累积引起。

接下来，对人群中检测出来的SVs相关的基因进行功能富集分析，发现267个通路与插入突变和缺失突变（图3a）相关，但未发现与基因倒位相关的通路，前30个通路中有19个通路是与多糖降解、鞘脂代谢等与代谢相关的通路；同时也发现一些与环境信息处理相关的通路（如磷酸转移酶系统(phosphotransferase system,PTS)和ABC转运蛋白等）。

为进一步研究SVs对机体功能（尤其是微生物代谢）的影响，对横断面队列的粪便、血清和尿液样本进行代谢组学分析，结果表明，SVs导致基因功能发生改变，从而使得SVs突变组中的菌与代谢物不相关，而不含SVs突变组中菌与代谢物显著相关。相关性分析表明，11个菌与粪便、血清和尿液中的代谢物显著相关，其中涉及到889个受SV影响的细菌-代谢物关联对（图3b,3c）。

SVs与代谢的关联分析发现，70个SVs影响了细菌与74个粪便代谢物显著性关联，31个SVs影响了细菌与66个尿液代谢物的关联，2个SVs影响了细菌与 2个血清代谢物显著关联。之前的研究中，inositol已被发现与Anaerostipes hadrus的缺失突变有关，而本文研究中发现Bacteroides uniformis基因组的基因座上插入突变和缺失突变均使得该菌与尿液样本中inositol的关联消失。12个SV-affected基因的存在，使得Fusicatenibacter saccharivorans与粪便样本中Neotrehalose的关联不显著（图3d）；同样，33个SV-affected基因的存在使得Agathobacter rectalis与F1P间的关联不显著（图3e）。功能分析的结果也表明SVs通过影响相关基因的功能对菌和代谢物关联产生影响。

为进一步研究SVs突变对表型的影响，选取横截面队列样本中受SVs影响的两个代谢物F1P和neotrehalose与空腹血糖做关联分析，发现F1P和neotrehalose均与空腹血糖显著负相关，且F.saccharivorans与空腹血糖也显著负相关，但在SVs亚组中，关联变得不显著（图3h）；SVs的存在也使得A.rectalis与glucose的关联减弱(图3i)。

由于噬菌体侵染细菌基因组和病毒的逃离均会导致SVs的产生，因此用ProphageHunter对所有MAGs进行分析，得到基因组大小在1236bp和91792bp间以长尾噬菌体Siphoviridae和肌尾噬菌体Myoviridae为主的2247个原噬菌体（图4a）。对原噬菌体元件和细菌基因组进行关联分析，得到1,077个原噬菌体-宿主对（图4b）；其中，只有72个在MVP数据库中；而二代测序数据只检测到1815个原噬菌体，其中80.77%在混合组装中检测到；从结果我们可以看出，ONT-二代混合组装数据更有利于原噬菌体的发现。

除原噬菌体外，菌群基因中还有用于抵抗病毒重复感染的CRISPR-Cas系统，该系统中loci的spacers包含有特定病毒的特征序列，可能与菌种的插入突变或者缺失突变有关。同样，对所有MAGs的分析发现了150058个CRISPR spacers，平均每个样本中1665±560个spacers，大部分的spacers是新发现的，只有17,600个（11.73%）在CRISPROpenDB数据库汇总，22962（15.30%）在西方人群的肠道菌群中出现；基于二代测序的组装方式，只发现了9542个spacers。由此我们也能看出，新的宏基因组组装方式具有更强的发现基因元件（如CRISPR spacers）的能力。

对原噬菌体/CRISPR spacers的β多样性分析发现（Jaccard distance距离），横截面队列中个体的差异性显著大于跟踪队列个体内的差异性。群体水平对原噬菌体和CRISPR spacers的组成分析表明两者间有较强的共变；能揭示原噬菌体和病毒群落组成间相关性的Procrustes分析结果表明，横截面队列中不同个体间原噬菌体和病毒组成显著相关（图4c）；对宏基因组数据中活性病毒序列的分析发现，2247个鉴定出的原噬菌体汇中有47个有潜在活性的，从而表明细菌基因中存在大量无活性的原噬菌体，从而保持SVs的稳定性。