在过去的十年里，定量蛋白质组学取得了长足的进步，成为生物和生物医学研究的重要工具。质谱法(mass spectrometry, MS)已成为蛋白质组研究的主要方法。尽管技术不断进步，由于蛋白质组的复杂性，比如蛋白质组的动态范围很大，检测整个动态范围的蛋白在定量灵敏度、准确性和精密度方面仍有改进的空间。此时，Astral（asymmetric track lossless，非对称轨道无损）质量分析仪作为一种新型高分辨率精确质谱仪应运而生。
百趣生物作为一家专业的质谱检测公司，强势引进Astral质谱仪，其具有以下技术优势[1][2]：
更深覆盖：nDIA技术实现高覆盖，高重复性
更高通量：快速实现蛋白深度检测
精确定量：nDIA可实现精确而准确的非标记定量
更高灵敏度：提升动态检测范围，实现低丰度蛋白检测
图1 Orbitrap Astral 高分辨质谱仪（百趣生物实拍仪器图）
百趣生物特意选取了常见的样本类型——组织、细胞和血清样本，为了让大家能够亲眼见证Astral的检测效果，进行了全面而精细的检测。这些样本类型具有广泛的代表性，能够充分展示Astral技术在不同样本中的应用潜力和优势。
高深度检测，检出数数量多：hela细胞检测蛋白数~10000，小鼠肌肉组织检测8000+，人血清检测蛋白数4000+，充分体现了Astral的检测深度高（图2 a）；
通过不同颜色的条形图可以看出三次技术重复结果，无论是precusors数量还是protein groups数量基本一致，说明了重复性好（图2 b）；
通过venn图分析（图2 a），可以看到在8 min和24 min的梯度内，24 min梯度检测蛋白在几乎覆盖８ min梯度蛋白的基础上，更能额外检出多达20%的蛋白数量，说明了检测的重现性高。相比于传统的检测同等数量的蛋白需要60 min或者更多，说明了Astral检测快速且高深度覆盖的性能。
图2 百趣生物Orbitrap Astral实测数据
以上是百趣生物提供的实测数据，充分展示了Astral技术的高深度检测和高重复性以及准确性和其快速检测的特点。通常来说，实践与理论相结合，会更具说服力。接下来，让我们一同通过发表在nature Biotechnology(IF=46.9)[1]和Journal of Proteome Research[2]的两篇权威期刊，从学术角度深度了解Astral技术的特点与优势。
DIA因其高重复性、高覆盖率和良好的定量性能，已成为短梯度单次深度分析蛋白质组的首选方法；在DIA中，共洗脱的多肽离子在预定义的质量分离窗口中被共分离和碎裂，从而产生包含来自多个多肽的碎片离子的复杂谱图。相反，DDA具有较高的特异性，这是因为分离窗口较窄，但多肽检测覆盖能力较差。虽然DIA可以通过限制类似于DDA的四极杆隔离宽度来实现更高的特异性，但以往的质谱仪无法实现在色谱时间尺度上使用足够窄的2-Th隔离窗口进行常规DIA所需的灵敏度和采集速度。
利用Astral质量分析仪，能够在高分辨率和高灵敏度下获得~200-Hz MS/MS采集率，从而允许使用窄的2-Th隔离窗口进行nDIA(narrow-window data-independent acquisition)分析（图3 a, b, c）。
图3 Reproducibility重复性和Accuracy准确性评估结果
利用以往的最先进的仪器，在大约1 h的LC-MS/MS时间内覆盖~4,000个酵母蛋白质；用nDIA(2-Th)跨越不同的LC梯度长度分析整个酵母细胞蛋白，仅8 min有效LC梯度(180 SPD)到15 min梯度(96 SPD)，获得了几乎完全的酵母蛋白质组覆盖(~4,500蛋白质)，比以前的技术快了10倍，并保持了很高的定量重复性（图4 a）。
相比之下，人类细胞蛋白质组包含>12,000个基因编码蛋白，动态范围高(~6logs),需要较长的MS测量时间才能全面覆盖。采用HEK293细胞用60 min有效LC梯度评估人类蛋白质组的覆盖率和nDIA(2-Th)法检测的灵敏度（HEK293蛋白肽段上样从100 ng增加到2,000 ng)，结果表明MS/MS信号随上样量的增加而变化，多肽和蛋白质的覆盖率和定量重复性也与上样量相关，当上样2000 ngHEK293蛋白肽段时，平均有9,879个蛋白质和159,627个独特多肽(164,216个修饰多肽)，上样100 ng时检测结果覆盖2000 ng的88%的蛋白质，可见nDIA(2-Th)法具有很高的灵敏度(图4 b, c)。
为了进一步挑战仪器灵敏度的极限，对从0.05 ng到10 ng的一系列HeLa蛋白肽段进行了DIA分析，还包括了12个单独的HeLa细胞制剂的分析。从0.05 ng蛋白肽段中鉴定~3,000个蛋白质，单个HeLa细胞表达鉴定的蛋白质大于4500。从0.25 ng起梯度稀释检测，约80%的蛋白质CV<20%。表明Orbitrap Astral MS仪器的灵敏度高（图4 d）。
图4 检测速度、蛋白覆盖度、重复性、灵敏度评估结果
Orbitrap Astral MS仪器展示了高度的技术重复性，大约90%的蛋白质具有的CVs<20%，并且在技术重复中的缺失值的数量很少(~3%)（图5 a, b）。与Orbitrap Exploris 480质谱仪相比，Astral分析仪中基于MS/MS的蛋白质定量结果在酵母和大肠杆菌的预期比例下具有更高的准确度和更低的标准偏差(~0.3)（图5 c）。
图5 精确性和准确性评估结果
Astral质谱仪的灵敏度和定量动态范围广非常适合于复杂的生物体液样本，如血浆。血浆样本由于含有高低丰度蛋白，动态范围广。解决动态范围问题的两种主要方法是增加质谱仪本身的动态范围，或者使用浓缩或去除策略来减小测量样品的动态范围。以往无论纳米磁珠富集还是其他方法，血浆中检测到的蛋白不超过2700；因此，血浆蛋白质组仍然是一个巨大的分析挑战。采用Astral对血浆富集的外囊泡(extracellular vesicles, EV)蛋白和总血浆中的蛋白进行定量检测。Astral以高精度检测结果超过4200种蛋白质（图6 a），说明Astral非常适合这些类型样本的测量，同时，相对总血浆蛋白而言，Astral可以检测很宽动态范围的经富集或去除的某些marker蛋白（图6 b）。
图6 Astral血浆蛋白组学检测结果
通过以上结果，我们不难发现，百趣生物实测数据的精准度与文献内容呈现出高度的一致性。这再次彰显了Astral和百趣生物无可挑剔的实力。如果您期望用高端的仪器加之强大的组学技术让您的研究和文章大放异彩，那么请不要犹豫，立刻与我们取得联系，让Astral为您展现其出色的检测能力吧！相信最终的检测结果定会给您带来意想不到的惊喜！
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参考文献：
[1] Ultra-fast label-free quantification and comprehensive proteome coverage with narrow-window data-independent acquisition. Nat Biotechnol. 2024;:. doi:10.1038/s41587-023-02099-7. [2] Heil LR,Damoc E,Arrey TN, et al. Evaluating the Performance of the Astral Mass Analyzer for Quantitative Proteomics Using Data-Independent Acquisition. J Proteome Res. 2023;22 (10):3290-3300. doi:10.1021/acs.jproteome.3c00357.
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