早产（PTB）是指婴儿出生在妊娠37周之前，是新生儿发病和死亡的主要原因之一。此前的研究表明PTB是一种多因素综合征，可能由病菌感染、氧化应激、炎症和孕妇围产期营养摄入等介导。然而，它们之间的关系尚待研究，PTB的生物学机制也不清楚。

目前，针对肠道菌群的研究越来越多，相关的模型研究表明它们与人类的健康可能存在因果关系，因此特定的肠道菌群有被用于疾病预测和治疗的潜力。与健康人群相比，临床患者的肠道菌群丰富度发生了显著性改变，如炎症性肠道疾病 、心血管疾病、2型糖尿病和代谢综合征等。

值得注意的是，肠道菌群的丰富度与人们的饮食结构密切相关，高脂肪低纤维的摄入会降低微生物的丰富度，带来极大的健康隐患。然而，关于饮食-微生物菌群对妊娠的影响知之甚少。本研究中，选择了不同饮食结构的孕妇为研究对象，通过对肠道微生物以及血浆和粪便中代谢物进行分析，发现了高脂肪低纤维饮食下自发性早产（SPTB）的生物标志物，为将来SPTB预测提供参考依据。 

表1. 受试人员基础信息及分娩情况统计

在孕妇妊娠20 ~ 26周的时候，收集了她们的粪便样本，并通过微生物检测评估肠道菌群的变化。为确定微生物群落在属水平上的多样性差异，对α-多样性进行了3个指标的评价：①Shannon指数，即样品中各属的比例（均匀度）；②丰富度，即样品中不同属的总数；③ Menhinick's 指数，属水平数量除以全部种的个体总数的平方根。结果表明，SPTB产妇的粪便微生物α-多样性指数均显著降低（图1A，Shannon指数P=0.043；图1B，丰富度P=0.009；图1C， Menhinick's 指数P=0.014）。

为了明确造成这种差异的分类学特征，作者对纲（Class）层级不同类别细菌的Shannon指数进行计算分析（图2A）。结果可知，SPTB人员中β-变形菌纲（Betaproteobacteria）细菌的Shannon指数显著降低（Wilcoxon’s秩和检验，FDR < 0.2）（图2B），另外逻辑斯蒂回归分析所得AUC为0.71（图2C）。但是， Betaproteobacteria中没有特定属的相对丰度在两组间存在显著差异。

图2. 菌群Shannon指数比较。(A)纲层级不同类别菌群比较；(B)β-变形菌纲在不同组中比较；(C)β-变形菌纲的逻辑斯蒂回归分析结果

通过加权和非加权统计方法分别得到Unifra距离，结果表明两组间存在显著差异（加权P=0.034和非加权P=0.013）（图3A，B）。然而，在FDR为0.20的情况下，无法根据属水平上的相对丰度（测试了106个属）确定任何具有统计学意义的差异类群。

图3. 粪便样本的β-多样性主成分分析。(A)加权计算方法；(B)非加权计算方法

为了确定与SPTB相关的其他分析特征，作者对孕妇产前就诊时收集的粪便和血浆样本进行了非靶向代谢组学检测。粪便样本共鉴定到824种代谢物，其中有22种在丰度上存在极显著差异（Wilcoxon秩和检验P<0.01）。经过多次比较校正（FDR<0.20）后，SPTB人员粪便的代谢物中二十二碳六烯酸（DHA）（22:6n-3）和二十碳五烯酸（EPA）（20:5n-3）均显著增加（图4A）。

图4. 粪便样本非靶标代谢组检测分析。(A)差异显著的代谢物聚类热图；(B)差异显著的饮食变量与粪便中差异显著代谢物之间的偏肯德尔相关系数聚类热图；(C)粪便样本代谢物模块与SPTB相关性的WGCNA分析

对于血浆样本，共检测到825种代谢物，其中有4种在丰度上存在极显著差异（P≤0.01），分别为β-柠檬基谷氨酸、丙酰甘氨酸、己酸和14-羟基二十碳己酸（HDoHE）。然而，经过多次比较校正后差异均不显著。

考虑到饮食摄入量和肠道微生物之间的关系，该研究中使用了3次24小时膳食营养的均值进行分析，各组的饮食营养成分如表2。相比于对照组，SPTB孕妇的每日营养摄入量显著更高的有：脂肪（90.2g比75.2g，P=0.028），饱和脂肪酸（31.4g比26.1g，P=0.045），棕榈酸（16.4g比13.7g，P=0.044），多不饱和脂肪酸（PUFA）（22.2g比16.5g，P=0.018），ω-3脂肪酸（2.7g比1.9g，P=0.014），ω-6脂肪酸（21.7g比16.3g，P=0.05），α-亚麻酸（2.3g比1.7g，P=0.009），ω-6亚油酸（19.1g比14.3g，P=0.024）和反式十八碳二烯酸 （0.45g比0.33g，P=0.015）等。另外，两组人员的其他营养成分摄入量虽存在一定差异，但在统计学上并未达显著水平，如单不饱和脂肪酸和△-tocopherol等。

作者使用偏肯德尔相关系数（partial Kendall correlations）分析了差异显著的饮食摄入变量与粪便差异显著代谢物之间的相关性，所得结果如图4B。饱和脂肪酸总摄入量（以棕榈酸为主）与粪便代谢物DHA、EPA、二十二碳五烯酸、糖类、胆固醇分解物和类固醇激素等呈显著正相关（P<0.05）。PUFA总摄入量（包括亚麻酸和亚油酸）与粪便中熊胆酸、硫酸脱氢表雄酮（DHEA-S）和孕烷醇酮/异孕烷醇酮硫酸盐含量呈显著正相关（P<0.05）。

除了对单个代谢物分析外，作者还使用了WGCNA来评估特定代谢模块或通路是否与SPTB相关。粪便样本的代谢物被分为20个模块，通过模块水平的相关分析鉴定出4个与SPTB高度相关的模块（图4C）。其中，与SPTB相关性最强的模块包括了26种代谢物，且ω-3脂肪酸显得十分重要。

表2. 受试人员平均每日膳食摄入量信息

肠道微生物α-多样性降低与SPTB的发生密切相关，尤其是Betaproteobacteria的分类菌群。在粪便样本的824种代谢物中，有22种代谢物（主要是脂类）在两组间存在极显著差异。其中，DHA和EPA在SPTB组中的含量显著高于对照组。通过WGCNA来评估特定代谢模块或通路与SPTB的相关性，结果发现高度相关的代谢物模块以DHA和EPA为主。另外，SPTB组和对照组孕妇在每日饮食中摄入的饱和脂肪（主要是棕榈酸酯）分别为31.38±7.37g和26.08±8.62g，差异达到显著水平（P=0.045），且与粪便中DHA和EPA代谢物含量呈显著正相关（P<0.05）。

总之，检测数据表明粪便中微生物α-多样性降低，脂质（DHA、EPA、DPA）及类固醇（DHEA-S和异孕烷醇酮）代谢物浓度的增加，这可能是高脂肪低纤维饮食结构女性未来预测SPTB相关度的生物标志物。