发表期刊：Journal of Translational Medicine
影响因子：8.44
作者单位：中国人民解放军陆军特色医学中心
百趣提供服务：TMT标记定量蛋白质组学
研究背景
败血症被定义为由于对感染的过度反应而导致的危及生命的器官功能障碍。败血症造成的器官损伤中最主要的是心肌功能障碍，而液体复苏是基本的治疗方法，常用的是乳酸林格氏液(Lactate Ringer's solution, LR)，但由于LR容易导致高乳酸血症，所以其复苏效果有限。苹果酸林格氏溶液(Malate Ringer's solution, MR)是一种新型的复苏晶体液，与LR相比，其含有更高浓度的苹果酸盐和碳酸氢根离子，而乳酸离子含量较低。而MR是否对败血症心肌损伤有保护作用有待进一步研究。
本研究构建了盲肠结扎穿刺(Cecal Ligation and Puncture, CLP)诱导的大鼠败血症模型，并采用脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)刺激心肌细胞，观察心肌功能、线粒体形态和功能。采用TMT标记定量蛋白质组学（百趣生物提供）探讨MR对心肌损伤的保护机制，进一步研究了由线粒体靶向聚合物内含苹果酸组成的TPP-PEG-PAMAM-苹果酸聚合物，以下简称TPP@PAMAM-MR的效果。
技术路线
研究成果
01MR对败血症大鼠心肌功能的保护作用
采用超声心动图评估心功能，结果表明，败血症大鼠左心射血分数(Left ventricular ejection fractions, LVEF)、心排血量(Cardiac output, CO)、心脏指数(Cardiac index, CI)和卒中指数(Stroke index, SI)明显降低。LR输注可轻微改善LVEF和心功能。MR输注后，LVEF、CO、CI和SI明显改善。
心脏病理切片苏木精-伊红(hematoxylin-eosin staining, HE)染色显示，正常心肌组织中心肌纤维结构有序，间质组织较少。败血症后心肌细胞明显膨大，形成空泡，心肌纤维排列杂乱，间质间隙变宽。LR输注仅能轻微缓解败血症引起的心脏组织学改变。MR组心肌细胞间质水肿明显缓解，间质间隙缩小，心肌纤维排列紊乱明显恢复。
心肌损伤标志物心肌肌钙蛋白T(Cardiac troponin T, cTnT)和乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase, LDH)在败血症后明显升高，表示心肌功能受损。LR输注后，cTnT水平略有下降，而LDH水平维持在较高水平。与LR组相比，MR组cTnT、LDH水平明显降低，心肌损伤明显改善。
败血症大鼠氧气的输送和耗氧量明显降低。输注LR后，氧气的输送和耗氧量略有改善。MR输注后，氧气的输送量和耗氧量明显增加。这些结果表明MR可显著改善败血症大鼠的心功能。
图1. MR对败血症大鼠心功能的影响02MR对败血症大鼠肝肾功能及存活率的保护作用
采用激光血凝仪检测败血症大鼠复苏后0h、1h、2h、3h的肝、肾血流情况。发现败血症导致肝、肾血流量明显减少。在复苏的前2h，LR输注改善了肝脏和肾脏的血流量，而在复苏的3h后，肝脏和肾脏的血流量下降。相比之下，MR输注在复苏3h时显著改善了肝、肾血流量。败血症组肺泡结构紊乱，肺间质水肿，肺泡腔内有大量红细胞和炎性细胞。MR治疗可减轻肺损伤，改善肺泡结构，减少间质水肿，减少红细胞和炎性细胞浸润，明显减轻肝肾功能损害。
败血症组和LR组血乳酸水平明显升高。MR输注后，败血症大鼠乳酸水平较LR组下降37.8%。败血症组无大鼠存活至24h，LR组生存时间较败血症组略有改善，而MR组生存时间明显延长。以上结果说明MR对败血症大鼠有改善肝肾功能、减轻肺水肿、抑制炎症因子释放、延长生存时间的作用。
图2. MR对肝、肾功能及生存率的影响
03败血症大鼠心肌蛋白质组学研究
作者针对LR组和MR组心脏组织进行了TMT标记定量蛋白质组学检测。一共检测到1227种显著差异蛋白，其中下调蛋白464个，上调蛋白763个。GO(Gene Ontology)富集分析发现，大部分蛋白位于细胞核，其次是细胞质和线粒体；差异蛋白主要参与细胞定位、蛋白质定位、有机氮代谢等生物过程；主要富集在蛋白结合、核苷酸结合、催化活性等分子功能中。且差异蛋白对线粒体电子传递有显著影响。此外，KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路分析发现，差异蛋白参与了细胞氧化磷酸化、凋亡、心肌收缩，提示MR可能调节心肌细胞的线粒体功能和凋亡。MR处理后促凋亡蛋白Cycs和糖酵解相关蛋白HK1表达明显降低，抗凋亡蛋白Bcl2l1表达明显升高。
图3. LR组与MR组的蛋白质组学分析
04MR对败血症心肌线粒体功能的保护作用
败血症后心脏组织中苹果酸水平下降，LR输注未使苹果酸水平升高。与LR组相比，MR组苹果酸含量显著增加。为探讨增加苹果酸含量是否能改善心肌细胞线粒体，本研究采用LPS刺激新生大鼠心肌细胞(neonatal rat cardiomyo-Cytes, NRCMs)。结果表明，LPS刺激可显著降低NRCMs的线粒体呼吸(mitochondrial Respiration, OCR)，MR输注可显著改善，而LR则无显著改善。进一步观察各组线粒体膜电位及ROS水平。LPS刺激后NRCMs线粒体膜电位明显降低，ROS荧光强度明显升高。与败血症组相比，LR输注后NRCMs的线粒体膜电位和ROS荧光强度没有改善。而MR输注可拮抗败血症诱导的线粒体膜电位和ROS荧光强度的变化，说明MR输注可减轻败血症诱导的心肌细胞线粒体功能损伤。
图4. 败血症后心肌细胞线粒体功能
05MR对线粒体形态的影响
透射电镜图像显示，正常心脏组织线粒体膜结构完整、规则致密，嵴膜排列有序。败血症后线粒体扩张成球形，出现空泡，基质疏松，嵴结构模糊，心肌线粒体数量增多。LR复苏可改善线粒体结构，线粒体碎片减少，肿胀程度略有降低。MR复苏后线粒体结构损伤明显减轻，线粒体基质恢复，嵴结构清晰，较LR组明显增加。
共聚焦显微镜图像显示，正常心脏胞浆中均有长条状的线粒体。败血症后ARCMs内线粒体呈严重碎片化，线粒体呈点状或球形。LR复苏不能消除ARCMs中败血症诱导的线粒体特征。而MR复苏可拮抗败血症诱导的线粒体碎裂，线粒体体积呈绳状，分布均匀。以上结果表明MR通过抑制线粒体分裂，维持线粒体健康形态，对线粒体功能起到保护作用。
图5. 败血症后心肌细胞线粒体形态06MR对败血症后心肌细胞凋亡的影响
蛋白质组学结果显示，MR输注可减轻心肌细胞凋亡。Western blot结果显示，LPS刺激后心肌细胞H9C2抗凋亡蛋白Bcl-xl和Bcl2的表达显著降低，而LR孵育后未逆转。MR接种后H9C2细胞中Bcl-xl和Bcl2表达明显增加。LPS刺激H9C2细胞后细胞色素C(Cytochrome C, Cytc)、caspase-3和Bax的表达明显升高。LR孵育后，上述蛋白的表达无明显变化。但MR孵育后Cytc、caspase-3和Bax的表达量分别显著降低至29.8%、58.1%和27.1%。
图6. MR对H9C2细胞凋亡的影响
07含苹果酸的靶向线粒体材料的合成
上述结果表明，MR可通过苹果酸保护心肌线粒体、抑制细胞凋亡来减轻败血症引起的心肌损伤。然而，由于苹果酸穿梭体的存在，L-苹果酸进入线粒体的效率会降低。为了提高苹果酸的生物利用度，合成了以苹果酸为载体，靶向心肌线粒体的新材料TPP@PAMAM@MA。
HE染色结果显示，TPP@PAMAM@MA给药后在肝、肾、心脏均无弥散，表明TPP@PAMAM@MA在体使用是安全的，免疫荧光结果显示TPP@PAMAM@MA可以有效地进入线粒体。将MR中原有的苹果酸替换为TPP@ PAMAM@MA得到新的复苏液TPP@PAMAM-MR(TPP-MR)。
图7. TPP@PAMAM@MA的表征
08TPP-MR对败血症的保护作用
与MR相比，TPP-MR显著提高了败血症大鼠的LVEF、CO和苹果酸水平。此外，虽然MR组生存时间明显长于败血症组，MR组24h生存率为25%，但TPP-MR组生存时间延长至19.3±5.0h，24h生存率为37.5%。心脏病理HE染色显示，与MR相比，TPP-MR进一步减少了败血症诱导的心肌细胞间质水肿，更好地恢复了心肌纤维排列紊乱。
在体外细胞水平进一步测定ATP含量和OCR。TPP-MR对LPS诱导的ATP下降的保护作用比MR更显著。LPS刺激显著降低了NRCMs的OCR， MR处理后OCR有所改善，而TPP-MR处理后OCR有明显改善。还观察了LPS刺激后TPP-MR和MR对NRCMs线粒体功能的影响。TPP-MR对NRCMs线粒体膜电位和ROS荧光强度的保护作用强于MR，此外，在H9C2细胞中也有同样的趋势。
用Mito tracker活细胞线粒体染料染色心肌细胞（H9C2细胞），在共聚焦显微镜下观察线粒体结构。MR治疗后，线粒体破碎程度降低。经TPP-MR处理后，线粒体碎片进一步缓解，线粒体恢复成条状，分布均匀。以上结果表明，TPP-MR在减轻败血症后心肌损伤方面优于MR。
图8. TPP-MR对败血症心肌损伤的影响
结论
与LR相比，MR复苏能明显延长败血症大鼠生存时间，改善心功能，减轻肝、肾、肺损伤。心肌组织蛋白质组学研究表明，MR和LR输液过程中的差异表达蛋白涉及氧化磷酸化、凋亡等。进一步研究发现MR降低ROS，改善线粒体形态和功能，最终增强线粒体呼吸，促进ATP生成。此外，MR输注降低了凋亡相关蛋白的表达，增加了抗凋亡蛋白的表达。通过合成靶向心肌线粒体包裹苹果酸的材料，提高了MR中苹果酸的生物利用度，TPP-MR对败血症大鼠心肌损伤有较明显的保护作用。这些发现可能为败血症的治疗提供新的见解。
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