近日，云南农业大学食品科学技术学院龚加顺教授团队与上海百趣代谢组学技术研究中心团队在Food Research International（IF=7.425）上发表了题为“Pu-erh Tea and Theabrownin Ameliorate Metabolic Syndrome in Mice via Potential Microbiota-Gut-Liver-Brain Interactions”的论文。
原云南农业大学食品科学技术学院龚加顺教授和上海百趣代谢组学技术研究中心创始团队刘志鹏高级研究员为共同通讯作者；云南农业大学食品科学技术学院侯艳博士为第一作者；云南农业大学食品科学技术学院张智芳等和上海百趣代谢组学技术研究中心研究人员范艳群为论文共同作者。
研究背景
代谢综合征（Metabolic syndrome, MS）是一种代谢紊乱性疾病，会增加Ⅱ型糖尿病、动脉粥样硬化和非酒精性脂肪肝等疾病的患病风险，约有四分之一的世界人口受此影响。近年来，随着MS发病率的增加及组学技术的发展，越来越多的研究表明MS的发生与肠道菌群密切相关，调整日常饮食能改变肠道菌群从而缓解代谢综合征的发生。普洱茶作为云南的一种传统茶饮，被报道对调节昼夜节律和饮食诱导的代谢综合征有一定效果。茶褐素作为普洱茶的重要组成成分之一，能通过升高血液中的高密度脂蛋白，降低血液中的总胆固醇、甘油三酯和低密度胆固醇等降低肝脏脂肪沉积。此外，普洱茶和茶褐素被报道在缓解肥胖和胰岛素抵抗及代谢综合征方面有一定效果，如普洱茶能够通过增加潜在有益菌群（双歧杆菌和阿克曼菌等）的相对丰度，并降低潜在有害菌群（幽门螺杆菌）的相对丰度，重塑MS患者的粪便微生物群的失调；茶褐素能够通过降低Firmicutes/Bacteroidetes比值、促进Bacteroides acidifaciens增加从而缓解代谢性疾病。虽然目前已有普洱茶或茶褐素干预高脂饮食诱导小鼠肥胖或代谢综合征的研究，但并没有将肠道菌群、转录本或代谢等多个水平同时进行组合研究，而且对于普洱茶和茶褐素两者在干预代谢综合征方面的异同，仍缺乏研究。
本文以普洱茶（Pu-erh，缩写为E）、茶褐素（theabrownin，缩写为B）和二甲双胍（metformin hydrochloride，缩写为Y）分别干预正常饮食和高脂饮食条件下的正常小鼠（K）和代谢综合征小鼠（MS，缩写为M）为研究对象（K，KE，KB，KY，MS，ME，MB和MY），通过联合16S rRNA扩增子测序、转录组、非靶标代谢组和靶标代谢组等技术平台，研究茶褐素和普洱茶干预对小鼠生理生化指标、粪便肠道菌群和短链脂肪酸、肝脏转录本、血清和脑组织代谢物的影响，对其缓解代谢综合征的潜在作用机制进行探究。
图1. 研究内容要点
研究结果
1.普洱茶和茶褐素干预改善MS小鼠体重和炎症及衰老等指标的变化干预期间，K组和K各干预组间及MS组和MS各干预组间小鼠的饮食量和饮水量无显著变化，但K组和K各干预组小鼠的体重和饮水量显著低于MS组和MS各干预组。同时，ME组小鼠体重降低最多，但饮食量最多、饮水量较少。与K组相比，MS组的胰腺重量显著降低，肝脏和脂肪组织重量显著升高，普洱茶和茶褐素干预能从一定程度上缓解MS引起的变化。此外，结合脂肪组织切片和脂滴面积，发现普洱茶在缓解体重增加和提高脂质代谢方面可能比茶褐素效果更好。
肝组织和空肠的病理切片表明普洱茶和茶褐素能有效缓解肝组织和空肠的损伤和炎症的发生；肝组织炎症指标（IL-1、IL-6和TNF-6），抗氧化指标（SOD和GSH），氧化指标（MDA）、胰岛素INS和血糖glucose指标分析结果表明，MS组的炎症指标显著升高，而二甲酸胍和茶褐素能显著地改善炎症因子的异常；MDA在MS小鼠显著升高，SOD和GSH在MS小鼠中显著降低，二甲酸胍和茶褐素菌同样能显著地缓解这些指标的异常；INS在MS小鼠中显著降低，glucose在MS小鼠中显著升高，二甲酸胍和茶褐素能显著改善INS的变化，但并不改变glucose的变化。综上，茶褐素在改善MS相关的炎症因子、氧化和抗氧化能力等指标方面可能比普洱茶效果更好。
图2. 普洱茶和茶褐素干预对小鼠生理生化、炎症及衰老指标的影响
2.普洱茶和茶褐素干预改善MS小鼠肠道菌群结构组成各组不同时间点的肠道菌群结果表明，小鼠在经历正常饮食模式切换到高脂饮食模式后，菌群α多样性出现降低，β多样性出现升高。从PCoA（principal co-ordinates analysis）图能明显看出不同干预对小鼠肠道菌群组成的变化轨迹，饮食模式切换对菌群的影响十分明显。此外，各组不同时间点的菌群组成结果表明高脂饮食后，Firmicutes/Bacteroides，Proteobacteria和Verrucomicrobia显著升高。
接下来，对实验终点的菌群数据进行分析，与K组及其干预组相比，MS组及干预组小鼠有更低的Firmicutes和更高的与产脂多糖和炎症相关菌Proteobacteria；MY组中的Bacteroides最高；KE组和KB组相对于K组α多样性显著增高，而MS组各干预组相对于MS组未发生显著变化；从PCoA和NMDS（Non-Metric Multidimensional Scaling）分析明显看出MS干预组更趋向于K，由此可看出普洱茶、茶褐素和二甲酸胍干预能够调控改善MS小鼠肠道菌群。
为进一步探索与普洱茶和茶褐素干预相关的关键细菌，结合时间序列lmer分析、MetaStats和Wilcoxon统计结果，发现相对K组，K组各干预组中有3个显著升高的细菌（Brevundimonas vesicularis, Veillonella parvula, Cutibacterium acnes ）和3个显著降低的细菌（Blautia coccoides, Desulfovibrio sp UNSW3caefatS, Firmicutes bacterium ASF500）；此外，相对MS组，在MS干预组中有抗炎作用的产短酸菌Clostridiales bacterium42_27和有抗炎和抗增重效果的Firmicutes bacterium ASF500显著升高。PICRUSt功能分析表明，普洱茶和茶褐素干预的MS小鼠组中，肠道菌群的功能层面上无显著影响，但普洱茶和茶褐素干预的K小鼠组中，肠道菌群参与的氨基酸和脂质代谢功能发生明显变化。综上，普洱茶和茶褐素能够通过调控肠道菌群进而减少炎症从而缓解代谢综合征，而且普洱茶和茶褐素对正常小鼠和代谢综合征小鼠的肠道菌群的调控是有差异的，表明对代谢综合征进行菌群调节的时候需要考虑饮食背景。
图3. 普洱茶和茶褐素干预对小鼠肠道菌群的影响
3.普洱茶和茶褐素干预影响MS小鼠肝脏节律基因表达为进一步探究普洱茶和茶褐素干预代谢综合征MS小鼠的潜在分子作用机制，对小鼠肝脏进行转录组学检测分析，累计发现5252个差异基因；对差异基因进行SPIA（Signaling-pathway impact analysis）通路富集分析发现，节律基因相关的通路在普洱茶和茶褐素干预小鼠肝脏中呈现显著变化，其中Npas2, Clock, Arntl和Cry1等节律基因在MS组及普洱茶和茶褐素干预MS组中均发生显著变化。相对普洱茶干预MS小鼠，茶褐素干预会影响调控更多与节律基因通路相关的基因（如Npas2, Clock, Arntl, Cry1, Per3, Per2和Bhlhe40等）。
图4. 普洱茶和茶褐素干预对小鼠肝脏基因表达的影响
4.普洱茶和茶褐素干预影响MS小鼠血清和脑组织脂质代谢对小鼠的血清和脑组织进行LC-MS/MS非靶标代谢学检测，发现K组，MS组及各自干预组的血清和脑组织样本中代谢轮廓谱出现显著变化，从血清和脑组织代谢组数据中分别找到259个和149个差异代谢物。差异代谢物的MetPA（ Metabolomics Pathway Analysis）通路分析表明，普洱茶和茶褐素可显著调节正常小鼠血清和脑组织甘油磷脂代谢和亚油酸代谢；普洱茶可显著干预MS小鼠血清中的甘油磷脂代谢和亚油酸代谢，而茶褐素的干预作用恰好相反，茶褐素显著影响的是MS小鼠脑组织中甘油磷脂代谢和亚油酸代谢。此外，普洱茶、茶褐素和二甲双胍还显著影响了MS小鼠脑组织中的嘌呤代谢。
图5. 普洱茶和茶褐素干预对小鼠血清和脑组织代谢的影响05关联分析探索研究普洱茶和茶褐素干预缓解MS的潜在机制
为进一步探索潜在作用机制，首先以差异肠道细菌、差异肝脏基因、差异血清和脑组织代谢物进行rdcv-PLS（partial least square-discriminant analysis incorporated into a repeated double cross-validations framework）关联分析，以|皮尔森相关系数|>0.6为标准，筛选出了19个肠道细菌，81个肝脏基因，71个血清和32个脑组织代谢物，从PCA（principal component analysis）图可看出这些筛选出的关键指标能够较好地区分各组。与前面肠道菌群结果中发现的7个关键细菌进行取交集，可以发现，rdcv-PLS模型筛选出了6个关键细菌，在普洱茶和茶褐素干预MS小鼠中，这6个关键细菌（C. bacterium 42_27, F. bacterium ASF500, B. coccoides, B. vesicularis, C. acnes, D. sp. UNSW3caefatS）与肝脏节律基因（如npas2, nr1d1, cry2, per3, arntl等）有较强的关联，且这些节律基因与脂质、氨基酸和嘌呤代谢相关的代谢物（如N, N-dimethylglycine, deoxyguanosine, deoxycholic acid(+), beta-guanidinopropionic acid, 12-hydroxydodecanoic acid等）显著相关。
图6. rdcv-PLS模型筛选出的关键变量
为研究关键细菌与基因和代谢物指标及炎症和衰老指标的关系，接下来对上述筛选得到的各项关键指标进行spearman相关性分析。结果表明，MS和ME组中，C. acnes与脑组织代谢物decanoic acid显著负相关，而与Clock、Npas2、MDA和IL-1正相关；C. bacterium 42_27与脑组织代谢物decanoic acid显著正相关，与Clock显著负相关。MS和MB组中，F. bacterium ASF500与血清代谢物3-dehydroxycarnitine和脑组织代谢物decanoic acid及Slc16a3, MDA, and IL-6显著负相关；与血清代谢物（如2-arachidonyl glycerol ether, 2-deoxyycastasterone, succinic acid semialdehyde），脑组织lysoPI（18:0/0:0）, Cry1, Cry2, Per2, Per3, Slc16a7,和INS显著正相关；B. coccoides与Slc5a8, IL-6和TNF-α显著负相关，与血清代谢物DG（18:3（9Z,12Z,15Z）/15:0/0:0），脑组织代谢物LysoPI（18:0/0:0），Per3, Olfr78和INS显著正相关；C. bacterium 42_27与血清代谢物linoelaidic acid, Clock, Npas2和IL-1,与血清脂质PC（P-18:1（9Z）/16:1（9Z），2-arachidonyl glycerol ether, deoxycholic acid(-)和deoxycholic acid(+)显著正相关。因此，普洱茶和茶褐素干预MS小鼠中，肠道菌群可能通过影响肝脏节律基因、短酸转运基因和短酸受体基因间的相互作用来调控改善代谢综合征，推测短链脂肪酸代谢可能是普洱茶或茶褐素影响肠道菌群的潜在靶点。
为进一步验证上述推测，对小鼠粪便样本中的短链脂肪酸进行检测；从分析结果发现，与肥胖相关的短链脂肪酸（acetic acid和propionic acid）和潜在有害短链脂肪酸（isobutyric acid和isovaleric acid）在普洱茶干预的MS小鼠组中显著降低，在茶褐素干预的MS小鼠中非显著降低。综上，茶褐素和普洱茶可能通过调节肠道菌群、短链脂肪酸代谢、血清和脑组织脂质代谢、肝脏中的炎症和衰老因子及昼夜节律基因表达来有效缓解代谢综合征。
图7. 关键变量间的相关性及普洱茶和茶褐素干预对小鼠短链脂肪酸的影响
结论
本研究以高脂饮食诱导的代谢综合征小鼠为研究对象，首次联合多组学技术（16S rRNA测序、转录组、LC-MS/MS非靶标代谢组和GC-MS靶标代谢组等）对普洱茶和茶褐素缓解代谢综合征的潜在机制进行探索，发现普洱茶和茶褐素可能通过“菌-肠-肝-脑”轴（肠道菌群-粪便短链脂肪酸代谢-血清和脑组织脂质代谢-肝脏炎症和衰老因子及昼夜节律基因）来改善代谢综合征；同时也发现了普洱茶和茶褐素干预在改善代谢综合征的效果及潜在靶点上具有一定的差异。本研究结果为普洱茶益生菌相关产品的开发提供了理论依据，为普洱茶产业的发展提供了科技理论支撑。
原文下载链接：
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0963996922012340
