发表期刊：Phytomedicine
影响因子：6.656
作者单位：江苏省中医院
百趣提供服务：中药非靶标代谢组学
研究背景
作为一种炎症性肠病(inflammatory bowel disease, IBD)，溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)常见于30-40岁的成年人，以腹痛、血性腹泻和里急后重为特征。5-氨基水杨酸(5-Aminosalicylic acid, 5-ASA)类、糖皮质激素类、生物制剂和免疫调节剂是UC的主要药物。尽管具有一定的治疗效果，但由于其副作用和高成本，这些药物的使用受到限制。因此，开发具有低不良反应率的替代治疗剂治疗UC势在必行。
辅助性T细胞17(T helper 17, Th17)的分泌物能介导炎症反应，在IBD患者的结肠粘膜中Th17细胞数增加。调节性T细胞(Regulatory T, Treg)具有维持免疫稳态的能力。IBD患者和患UC小鼠的Treg数均降低，UC的发生和发展受到Th17和Treg细胞之间不平衡的显著影响。
NOD样受体家族热蛋白结构域6(NOD-like receptor family pyrin domain containing 6, NLRP6)在肠道和肝脏中具有高水平的表达，并在调节炎症，维持上皮完整性和调节免疫稳态方面发挥作用。NLRP6在肠道细胞内募集ACS（Adaptor Apoptosis-associated Speck，一类蛋白，在症状严重的炎症部位中性粒细胞中ASC表达增多）形成炎症小体，最终与Caspase-1聚合共同参与促使IL-1β和IL-18（二者都属于白介素）成熟。IL-1β和IL-18对于炎症的调节起着重要的作用，与正常小鼠相比，NLRP6缺失的小鼠DSS诱导后表现出更严重的结肠炎症，同时IL-18水平降低。IL-18还能够维持结肠中的肠屏障完整性。IL-1β通过激活IL-1受体(IL-1R)信号传导促进Th17细胞分化和膨大。因此，预计NLRP6信号传导可能成为UC治疗的新靶点。
中药清肠化湿颗粒（以下简称为：QCHS）在中国广泛用于治疗溃疡性结肠炎。本文作者先前的研究证实QCHS颗粒和QCHS的多种中药成分在实验性结肠炎模型中的药理活性。然而，QCHS的作用机制和作用靶点有待进一步探索。本次研究就旨在评估QCHS对结肠炎的治疗效果并揭示其作用机制。
实验方法
在进行所有实验之前，使用UHPLC-QTOF-MS法对QCHS提取物中的有效成分进行了定性分析（由百趣生物提供）。后续实验流程如下：
动物实验中实验分组名称与处理方式详见对照表：
表1. 动物实验组名称与处理方式对照表
实验结果
1.QCHS颗粒草药成分的UHPLC-QTOF-MS分析结果
正、负模式下QCHS提取液的总离子色谱图(TIC)如图1所示，鉴定了每种草药的代表性化合物质谱峰位置被标记在图上并列于表2。
图1. 通过UHPLC-QTOF-MS分析QCHS的正(A)负(B)模式下总离子色谱图(TIC)
表2. QCHS中生物活性化合物的化学特性
2.QCHS能减轻小鼠DSS诱导的结肠炎
作者通过建立DSS诱导的UC模型以评估QCHS的作用（图2A）。DSS处理7天后，与对照组相比，模型组体重减轻，疾病活动指数(DAI)增加，结肠长度缩短，而QCHS和5-ASA治疗显著减轻了DSS诱导的UC症状（图2B–E）。H＆E染色评估UC小鼠的病理损伤结果：DSS组结肠有隐窝丢失，炎性细胞浸润和明显的粘膜损伤。然而，QCHS和5-ASA明显缓解了结肠组织的病理状态（图2F）。总的来说，结果表明QCHS治疗改善了DSS诱导的UC小鼠的病理体征，高剂量QCHS的治疗效果优于5-ASA（图2B-F）。
图2. QCHS治疗减轻了DSS诱导的小鼠结肠炎
3.QCHS治疗能抑制UC小鼠的结肠炎症反应
作者检测了血清中经典促炎细胞因子的水平。DSS给药可显著提高IL-6，IL-1β和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的水平，而QCHS治疗后可显著降低三者的水平（图3A-C）。丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)和核因子-κB(NF-κB)的信号转导与炎症反应密切相关，数据表明QCHS治疗降低了MAPK（JNK，ERK和p38）(D)和NF-κB途径的核心分子：IKKα/β，IκBα和p65的磷酸化水平(E)。上述结果表明QCHS显著抑制了DSS诱导的炎症反应。
图3. QCHS抑制UC小鼠结肠组织的炎症反应4QCHS促进UC小鼠的粘膜完整性
如图所示，DSS诱导后杯状细胞的数量和粘蛋白产生的减少，但在QCHS处理后显著增加（图4A）。Claudin-5和粘蛋白2(Muc2)是维持肠屏障完整性的关键成分，从mRNA和蛋白质水平(B-D)来看，QCHS处理后两者都得到了改善。该数据表明，使用QCHS治疗可以增强UC小鼠的粘膜完整性。
图4. QCHS改善UC小鼠肠粘膜的完整性
5.QCHS维持UC小鼠Th17/Treg的平衡
如图5A所示，QCHS处理后UC小鼠MLN中Th17的水平降低，同时Tregs的比例显著增加（图5B）。QCHS使Th17-特异性转录因子和细胞因子（RORγt，IL-17和IL-22）下调（图5C），而Treg的mRNA水平表征转录因子叉头框蛋白P3（Foxp3），细胞因子IL-10和TGF-β上调（图5D）。Western blot分析结果表明在蛋白质水平也有相同的趋势（图5E）。因此，QCHS重新调整了Th17和Tregs的平衡，以维持UC小鼠肠道免疫的稳态。
图5. QCHS纠正了UC小鼠的Th17/Treg失衡
6.NLRP6信号传导参与QCHS对UC小鼠的治疗作用
许多研究报道NLRP6在调节结肠炎和Th17分化中具有重要功能。检测NLRP6炎性体信号通路的激活情况，结果显示NLRP6在正常小鼠中高表达，但在DSS给药后显著降低，随后通过QCHS处理，这种趋势发生逆转（图6A）。DSS给药后，小鼠结肠组织中核心炎性体成分NLRP6，ASC和IL-18的mRNA水平降低，但QCHS治疗后显著升高（图6B-D）；DSS处理后Caspase-1的表达增加，又经QCHS处理后其表达明显降低（图6E）。Western blot结果表明，QCHS激活NLRP6和ASC的表达，同时调节IL-1β和IL-18的成熟（图6F），结果表明QCHS可能对体内NLRP6信号传导具有调节作用。
图6. QCHS促进体内NLRP6炎性体信号传导途径的激活
7.QCHS在体外抑制LPS诱导的炎症并激活NLRP6信号传导
作者通过用LPS（1μg/ml）建立细胞炎症模型，评估含QCHS血清的作用。结果使用含QCHS的血清处理后显著降低了IL-6、IL-1β和TNF-α的相对水平（图7B-D）。同样，NLRP6炎症小体信号通路的主要分子NLRP6、IL-18和ASC在LPS刺激下降低，但在含QCHS的血清处理后显著升高（图7E-G）。Western blot分析条带的结果与体内实验也相似（图7I）。这些结果显示，含QCHS的血清影响了体外炎症反应，其机制可能与NLRP6通路有关。
图7. 含有QCHS的血清抑制LPS诱导的细胞炎症并激活NCM-460细胞中的NLRP6信号传导途径
为了揭示NLRP6是否是QCHS介导的炎症反应调节的功能靶标，使用转染NLRP6小干扰RNA（siNLRP6）以干扰正常人肠上皮细胞系NCM-460中NLRP6的表达。结果表明，阻断NLRP6信号传导可能导致QCHS的炎症调节作用的消除（图8）。因此，可以认为QCHS的治疗效果与NLRP6的激活有关。
图8. NLRP6干扰消除了QCHS介导的细胞炎症调节
讨论与总结
在正常状态下，Th17细胞分泌特定的炎性细胞因子以维持宿主免疫，而Tregs抑制Th17的过度激活以保持平衡的免疫功能。Th17异常升高或Treg功能缺陷可能导致UC的发展。因此，靶向调节Th17/Treg是治疗UC的有效方法，植物药物是潜在的治疗剂。IL-18和IL-1β的成熟直接依赖于NLRP6的激活。因此，NLRP6信号有望成为UC的新靶点。
然而，目前的药物仍然主要用于维持或诱导缓解，由于这些药物的缺陷，UC患者仍然面临“治疗上限”。有积极迹象表明，中药在治疗UC方面具有潜在的治疗能力。在中国的一项随机临床试验中，QCHS已被临床证明对活动期UC有效且安全。
本次研究中报道了QCHS的治疗效果，并揭示了QCHS在UC小鼠中的可能机制。QCHS治疗减轻了UC的症状，表现为体重和结肠长度的恢复，DAI指数降低，粘膜损伤减轻。此外，与5-ASA相比，高剂量QCHS显示出优异的治疗效果。QCHS治疗还抑制了过度的炎症反应，在UC小鼠中保持结肠的粘膜完整性有助于UC小鼠结肠粘膜的深度愈合。最重要的是，本研究探索了QCHS的免疫调节功能。QCHS重新平衡了Th17/Treg的水平，从而保护小鼠免受结肠炎。从机制上讲，NLRP6炎性体信号通路参与QCHS介导的UC保护（图9）。QCHS显著激活NLRP6的表达并调节IL-1β和IL-18的成熟，因此发挥抗炎作用。进一步的体外实验表明，QCHS的功能依赖于NLRP6的激活。
图9. QCHS免疫调节和结肠保护作用的图形摘要
综上所述，QCHS对UC的临床治疗效果是肯定的，但其作用机制仍不清楚。本次研究结果探索了QCHS的可能靶点，为QCHS的抗炎和免疫保护作用提供了证据，并可能为其作为UC替代治疗策略的发展提供机制基础。
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